鱼腥草素钠增强亚胺培南抗铜绿假单胞菌生物被膜作用.docVIP

鱼腥草素钠增强亚胺培南抗铜绿假单胞菌生物被膜作用 　　[摘要]目的：研究鱼腥草素钠联合亚胺培南增强抗铜绿假单胞菌生物被膜的作用。 　　方法：2倍稀释法测定被试药物最小抑菌浓度（MIC），结晶紫染色法检测1/2MIC，1MIC，2MIC 的鱼腥草素钠（SH）、亚胺培南（IMP）单药组和1/2MIC的SH与IMP各药物浓度联合组对黏附菌的清除量、生物被膜生长量、藻酸盐产生量的影响。FDA-PI荧光素双染法荧光显微镜下观察各药物组膜分散后死活细菌、生物被膜形态。 　　结果：鱼腥草素钠能增强亚胺培南抗绿假单胞菌生物被膜的作用，尤以2MIC药物浓度联合组作用最强（与阴性对照组比较P[1]，因而，寻找以生物被膜为靶向的药物，是治疗生物被膜相关的慢性难治性感染的重要策略并成为全球关注的热点。铜绿假单胞菌（Psedomonas aeruginosa，Pa）是一种革兰阴性的条件致病菌，也是生物被膜最典型的模式菌，由于该菌天然的多耐药性且极易形成生物被膜的特点，慢阻肺、肺囊性纤维化、艾滋病等免疫力低下患者一旦感染很难治愈[2-3]。目前这些感染的治疗以抗生素为主，由于膜内菌较浮游菌对抗生素的耐药性提高10～1 000倍[4]，单用抗生素很难清除生物被膜。有报道抗生素与清热解毒类中药的联合治疗可以提高疗效[5]，其机制是否与能提高抗生物被膜作用有关，本实验研究鱼腥草素钠（sodium houttuyfonate，SH）与亚胺培南（imipenem，IMP）联合，探究两药联合后对抗铜绿假单胞菌生物被膜的增强作用。 　　1材料 　　1.1菌株和药物SH标准品（中国食品药品检定研究院，批号100247-199601）；IMP（深圳市海滨制药有限公司，批号101025362）；实验菌株铜绿假单胞菌ATCC27853（Pa27853）（中国食品药品检定研究院）。 　　1.2试剂和仪器胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）；MHB培养基、LB培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）；藻酸盐标准品、荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光染料PI（碘化丙啶）均为Sigma产品；结晶紫染液（法国梅里埃公司）。TU-1901双光束分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机；全温空气摇床GLY系列（上海福玛实验设备有限公司）；BX51荧光显微镜（Olympus公司）。 　　2方法 　　2.1菌液制备实验菌株接种于LB培养基中，37 ℃摇床220 r?min-1增菌6 h后置于离心机中2 000 r?min-1离心10 min，弃去上清液，加入生理盐水调制成0.5Mc的菌悬液再稀释200倍后备用。 　　2.2SH，IMP对Pa27853的MIC药物溶解后，用MH（B）肉汤培养基在24孔培养板稀释药物10个最终浓度：512，256，128，64，32，16，8，4，2，1 mg?L-1，每孔500 μL，同时设置1个不含药培养基作为阴性对照，每孔加入上述制备好的菌液500 μL，37 ℃孵育24 h后观察结果，以无菌生长的最大稀释度为MIC，实验重复3次。 　　2.3SH，IMP单药组及两药联合组对Pa27853生物被膜生长量的影响实验分成SH，IMP 2，1，1/2MIC药物浓度单药组，及1/2MIC SH分别与IMP 2，1，1/2MIC药物浓度联合组，另设不含药物空白组为阴性对照，共10组，n=4。96孔板中，每孔中加入调整好的Pa菌悬液200 μL，37 ℃静置孵育24 h，弃菌液PBS冲洗浮游菌，分别加入含上述各药物浓度的TSB培养基，阴性对照组换不含药培养基继续孵育，每隔1 d更换含药培养基，参照文献于给药后1，3，7 d，用4 ℃PBS清洗96孔中上的浮游菌[6]，每孔加入200 μL 1%结晶紫染液染色20 min。去离子水漂洗至漂洗液无紫色染料，待干后，加入95%乙醇200 μL脱色。脱色液转移至比色皿，加入95%乙醇3 mL稀释，用紫外分光光度计测定570 nm处的吸光度A。以阴性对照的A为100%生物被膜，换算各药物组生物被膜生长量计算抑制百分率。 　　2.4药物对Pa27853膜分散细菌及生物被膜形态的影响作用无菌盖破片作为载体置于6孔培养板中，加入2 mL TSB培养基，0.2 mL菌液，37 ℃孵育1 d后取出盖玻片，弃培养基，盖玻片用无菌PBS充分漂洗洗去浮游菌，重新置入孔内，各药物组加入2MIC浓度含药培养基，阴性对照组加不含药培养基，每隔24 h重复上述处理，7 d后，取出盖玻片，FDA-PI荧光染料染色观察膜分散后的死活细菌，即FDA用丙酮配成100 mg?L-1工作浓度，PI工作浓度60 mg?L-1，先用FDA染色5 min后，再用PI染色5 min，死细菌被PI染成红色，活细菌被FDA染成绿色。 　　2.5各药物组对Pa