SphK1突变抑制高糖培养系膜细胞纤维连接蛋白过度表达研究.docVIP

SphK1突变抑制高糖培养系膜细胞纤维连接蛋白过度表达研究 　　[提要] 目的 研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）突变是否抑制了高糖培养的系膜细胞中纤维连接蛋白（FN）的过度表达。 方法 采用Western blot检测FN的表达。 结果 系膜细胞转染了SphK1突变质粒后可消除高糖诱导的FN上调效应。 结论 本研究结果证明了SphK1在高糖诱导的系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。 　　[关键词] SphK1；纤维连接蛋白；系膜细胞 　　[中图分类号] R587.2；R692.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）15-0010-02 　　系膜细胞（Mesangial cell，MC）是肾小球的主要功能细胞，无论在肾脏的生理功能还是病理变化中均发挥着重要的作用；现已认为MC主要参与了糖尿病肾病肾小球硬化损伤过程。FN是由系膜细胞产生的细胞外基质的重要成分之一，在糖尿病状态下，肾小球系膜细胞FN等细胞外基质的积聚，导致肾小球硬化、促进糖尿病肾病的病变进程[1]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase， SphK）是催化S1P生成的关键限速酶[2]。我们前期研究表明：用四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型12周后，模型组小鼠在肾小球结构异常、肾功能降低的基础上，SphK1蛋白表达与活性较正常组相比明显升高；免疫组化结果显示，小鼠肾组织的SphK1主要表达于肾小球细胞，而模型组与正常组相比显著升高[3]，提示在糖尿病状态下SphK1的激活可能参与了糖尿病肾病的病变进程。本研究重点观察SphK1对细胞外基质主要成分-FN的调节作用，探讨糖尿病状态下高糖激活的SphK1对系膜细胞FN生成的具体分子机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 肾小球系膜细胞原代培养 　　采用逐级过筛法从SD大鼠的肾脏分离得到肾小球，用完全培养基（DMEM+20%胎牛血清+胰岛素 0.66 U/mL+ 2 mM谷氨酰胺+青霉素100 U/mL+链霉素100 μg/mL）约2滴，用吸管重悬肾小球，加入塑料培养瓶中，向各方向轻轻转动培养瓶，使含肾小球的细胞悬液均匀分布于瓶底，待细胞悬液近干时，然后迅速倒转培养瓶（使培养面朝上），加入约5 mL完全培养液，放入CO2孵箱内培养，4 h后，再轻轻将培养瓶翻转过来。待原代肾小球系膜细胞长满瓶底后，吸弃培养瓶内的培养基，用PBS冲洗培养瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化约1～3 min，镜检发现细胞突起回缩，细胞间隙增大，或轻轻振动后绝大部分细胞悬浮、漂移，立即加入含血清培养基终止消化，于1000 rpm离心5 min，传代培养基悬浮GMC至所需浓度，按1∶2比例传代培养。实验采用第3代到第15代之间的细胞。 　　1.2 质粒和瞬时转染 　　空载体（Vector），突变型质粒（SphKG82D）由澳大利亚Dr. Pu Xia赠送。按照产品说明书采用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染系膜细胞72 h后收集细胞。 　　1.3 Western blot 　　细胞经裂解提取蛋白后，经SDS电泳分离后，转膜至PVDF。采用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，将一抗、二抗孵育后，采用增强型的化学发光液检测条带信号。膜重孵鼠单抗 α-tubulin作为内参对照。 　　1.4 统计学分析 　　数值采用均值±标准差表示。采用单因素方差分析结合Bonferroni校正分析多组间的统计学差异，P 　　[参考文献] 　　[1] Raptis AE， Viberti G. Pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109 Suppl 2：S424-437. 　　[2] Taha TA， Hannun YA， Obeid LM. Sphingosine kinase： biochemical and cellular regulation and role in disease[J]. J Biochem Mol Biol，2006，39（2）：113-131. 　　[3] Lan T， Shen X， Liu P， et al. Berberine ameliorates renal injury in diabetic C57BL/6 mice： Involvement of suppression of SphK-S1P signaling pathway[J]. Arch Biochem Biophys，2010，502（2）：112-120. 　　[4] Kohama T， Olivera A， Edsall L， et al. Molecular cloning and