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人参锈腐病及疫病生防放线菌筛选 　　摘要：为获得对人参锈腐病、疫病具有拮抗活性的土壤放线菌，利用平板稀释培养法从黑龙江省人参基地和西北地区分离获得578株放线菌，用琼脂块法初筛，用生长速率法、悬滴法对抑菌效果较好的菌株进行抑菌活性复筛。结果获得5株对病原菌具有显著拮抗性的生防放线菌，其中Act11、Act12菌株的拮抗效果尤为显著，Act12最大抑菌圈直径达20.15 mm，其发酵液对病原菌菌丝的抑制率最大为83.4%，对人参锈腐病孢子萌发抑制率最高为 99.8%。 中国论文网 /1/viewhtm 　　关键词：人参；生防放线菌；筛选；诱腐病；疫病 　　中图分类号： S435.675文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0173-04 　　收稿日期：2015-03-20 　　基金项目：黑龙江八一农垦大学博士启动基金（编号：XDB2015-17）。 　　作者简介：张鸿雁（1970―），女，黑龙江宝清人，博士，教授，研究方向为微生物资源与利用。E-mail：zhy2219@163.com。人参根系病害包括根腐病、锈腐病、立枯病、疫病、菌核病等，其中锈腐病、疫病危害严重。人参根系病害虽可以采用农艺措施预防[1-2]，但目前主要通过化学农药防治[3]，该方法会造成人参药用部分农药大量残留，严重影响人体健康及疗效。因此，利用生物技术防治人参根系病害较之于其他作物更为重要，是保证人参药材安全性的必要措施。生物制剂具有施用安全、不污染环境、不产生抗性等优点，具有良好的应用前景。目前国内外关于人参根系病害的生物防治研究主要集中在生防细菌[4]、生防真菌方面[5]，对生防放线菌研究的报道较少。放线菌作为抗生素的主要产生菌，在自然界中分布广泛，产生活性物质的能力强，活性物质种类多，是值得关注的生防菌资源。本研究筛选对人参锈腐病、疫病病原菌有拮抗作用的生防放线菌，旨在为人参根系病害生物防治提供有较强拮抗作用的放线菌菌株。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1供试菌株供试病原菌共 5 株，分别为人参锈腐病菌3.3591（Cylindrocarpon destructans 3.359 1，以下简称3.3591），人参锈腐病菌R2（以下简称R2），西洋参锈腐病菌81782（C. destructans 81782，以下简称81782），西洋参锈腐病菌81783（C. destructans 81783，以下简称81783），西洋参恶疫霉81805（Phytophthora cactorum 81805，以下简称81805）。其中81782、81783 为相同病原菌的不同菌株，选用不同菌株的目的是研究不同生防放线菌对同一菌种不同菌株抑制作用的差别。供试放线菌共578株，其中408株分离自黑龙江省铁力市桃山镇人参土壤，170株筛选自青海、西藏、新疆等地区土壤的拮抗放线菌，由西北农林科技大学微生物资源研究室提供。 　　1.1.2培养基用马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）分离、纯化、活化、保存病原菌。用高氏1号琼脂培养基（GA）活化、拮抗性琼脂块制备培养放线菌。用GA液体培养基制备放线菌发酵液。 　　1.2方法 　　1.2.1皿内拮抗性筛选平皿初筛采用琼脂块法[6]。将制备好的病原菌菌悬液均匀涂布于PDA平板上，用打孔器从培养7 d的待筛放线菌平皿中打取直径5 mm的放线菌琼脂块，正置于PDA平板上，28℃培养5～7 d，测定抑菌圈直径及抑菌圈透明度。皿内复筛：将初筛得到的具有良好拮抗效果的放线菌菌株进行2次皿内拮抗复筛，方法同皿内初筛。计算不同抑菌程度的拮抗菌占供试放线菌的比例（S）和占拮抗放线菌的比例（A）。根据拮抗环宽度、透明度、放线菌产孢量，挑选出有应用价值的拮抗菌。 　　S=不同抑菌程度拮抗菌株数供试放线菌株数×100%； 　　A=不同抑菌程度拮抗菌株数供试拮抗放线菌株数×100%。 　　1.2.2无菌发酵滤液抑菌率测定无菌发酵滤液制备：将供试放线菌以一定比例接种到液体培养基中，28℃、150 r/min摇床振荡培养9 d。将发酵液4 000 r/min离心5 min后，用0.45 μm灭菌微孔滤膜过滤除菌，得无菌滤液。 　　采用生长速率法[7]测定相对抑菌率。将滤液与冷却至40℃左右的PDA培养基按体积比1 ∶4混匀倒平板，以同比例加入无菌水的PDA培养基为对照。用5 mm打孔器分别打取5株病原菌菌饼，置于PDA平板中央，每个处理3次重复，25℃培养7 d，定时测量菌落直径，计算相对抑菌率（X）。 　　抑菌率（X）=（对照菌落直径-5）-（处理菌落直径-5）对照菌落直径-5。 　　1.2.3无菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响病原菌孢子悬液制备：将活化好的病原菌