乌司他丁对大鼠缺血再灌注心肌细胞保护机制.docVIP

乌司他丁对大鼠缺血再灌注心肌细胞保护机制 　　[摘要] 目的 观察乌司他丁对心肌缺血再灌注后大鼠心肌细胞的保护机制。 方法 采用垫扎球囊法结扎冠状动脉制作心肌缺血再灌注的动物模型，30只大鼠随机分为三组：假手术组（n=10）、缺血/再灌注（I/R）组（n=10）和I/R+乌司他丁组（n=10）。检测三组心肌组织谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）及血清标志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，采用TTC染色确定心肌梗死及缺血范围，并用Western-blot测定炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、IL-8的表达。 结果 与假手术组比较，I/R组中反映氧化损伤程度的MDA明显升高[（4.13±3.27）nmol/L比（11.13±2.13）nmol/L]，CK-MB也升高[（15.21±6.24）U/L比（2752.21±1276.36）U/L]，GSH则明显降低[（241.42±3.28）mg/L比（184.26±2.14）mg/L]，差异均有高度统计学意义（P 　　[关键词] 心肌缺血再灌注；炎症因子；乌司他丁 　　[中图分类号] R331.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（b）-0013-03 　　乌司他丁是一种广谱的蛋白水解酶抑制剂，可以抑制体内多种蛋白水解酶的活性，调节炎症细胞因子的释放，减少炎症细胞浸润[1]。研究表明氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、中性粒细胞和细胞凋亡等因素均可能参与心肌缺血再灌注损伤心肌的发病过程[2-3]。本实验检测了乌司他丁对缺血再灌注细胞的心肌组织梗死范围及白细胞介素-6（IL-6）、IL-8的表达，探讨乌司他丁对心肌缺血再灌注损伤的保护机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及试剂 　　取10周左右雄性SD大鼠30只，体重（200±20）g（南昌大学动物实验中心提供），乌司他丁注射液，100 000 U/瓶（广东天普生化医药股份有限公司生产，批，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒（武汉亚法生物制品有限公司生产），anti-IL-6、anti-IL-8、小鼠单抗辣根酶标记兔抗山羊IgG、anti-β-actin山羊单抗（SantaCruz产品）。 　　1.2 分组及模型制作 　　30只SD大鼠随机分为3组，分为假手术组、缺血再灌注（I/R）组、I/R+乌司他丁组，每组各10只。假手术组，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。I/R组参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法制作大鼠模型。将充盈的球囊（215 mm×10 mm）垫于冠状动脉前降支与结扎线之间，用力结扎，观察结扎区域变白，局部心肌运动减弱，两个以上导联上出现ST段明显上抬，提示结扎成功。45 min后将球囊快速抽空便可即刻实现前降支血流再灌注（以心电图相关导联ST段明显回落为标准），并持续再灌注3 h。I/R组，结扎冠状动脉后5 min分别通过尾静脉接受静脉注射注射生理盐水，45 min后放松扎线使冠状动脉再通形成再灌注3 h至实验结束；I/R+乌司他丁组结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉注射乌司他丁（50 000 U/kg），其余同I/R组。 　　1.3 生化指标检测 　　缺血再灌注120 min后自腹主动脉取血6 mL，静置30 min，4℃3000 r/min离心10 min，离心半径为5 cm，分离血清。按照试剂盒说明采用化学比色法测定血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）和MDA、谷胱甘肽（GSH）含量。 　　1.4 心肌缺血和梗死范围测定 　　通过2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色将心肌切片梗死区染成灰白色，缺血区染成砖红色，非缺血区染成蓝色，扫描后采用图像分析软件分别计算各部分的面积。缺血的范围用缺血心肌面积与左心室面积之比表示，而梗死范围以梗死心肌面积与缺血心肌面积之比表示。 　　1.5 Western blot法检测IL-6、IL-8蛋白水平 　　分别取适量三组大鼠心肌组织，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，洗涤缓冲液（TBST）常温下封闭过夜后，分别加入小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。 　　1.6 统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P 　　2.2 心肌缺血范围和梗死面积 　　假手术组未见心肌缺血及梗死，I/R组、I/R+乌司他丁组心肌缺血范围分别为（49.72±5.36）%、（51.12±6.24