阴道局部HBD2及LL37浓度及基因表达与RVVC发病关系.docVIP

阴道局部HBD-2及LL-37浓度及基因表达与RVVC发病关系 　　摘要：目的 通过检测RVVC阴道局部HBD-2、LL-37的蛋白浓度及基因表达，探讨其与RVVC发病的关系。方法 选取我院门诊RVVC28例，VVC30例，健康体检者30例，Elisa法检测阴道灌洗液上清HBD-2、LL-37蛋白浓度，荧光定量PCR检测灌洗液沉淀脱落细胞HBD-2、LL-37的mRNA水平。结果 ①VVC组HBD-2、LL-37的蛋白浓度显著高于对照组及RVVC组；RVVC组HBD-2、LL-37的蛋白浓度较对照组降低。②VVC组HBD-2、LL-37的mRNA水平高于对照组，RVVC组HBD-2、LL-37的mRNA水平低于对照组。结论 HBD-2、LL-37参与阴道局部抗感染的固有免疫过程；HBD-2、LL-37的低表达可能是RVVC反复发作原因之一。 　　关键词：复发性外阴阴道假丝酵母菌病；HBD-2；LL-37; PCR 　　外阴阴道假丝酵母菌病（vulovaginal candidiasis，VVC）是女性多发病。抗真菌药的广泛使用并没有使该病发病率下降，VVC发病率约占所有外阴阴道炎中的39%，居第一[1]。5%~10%的患者反复发作，成为复发性外阴阴道假丝酵母菌病（recurent vulovaginal candidiasis, RVVC）。研究表明[2]，RVVC发病与患者阴道局部免疫功能异常有重要相关性。人防御素2（HBD-2）及抗菌肽LL-37是人固有免疫系统的重要成分。本研究通过测定RVVC患者局部两种因子的浓度及基因水平，探讨阴道局部固有免疫与RVVC发病的关系，为今后其免疫治疗提供依据。 　　1资料与方法 　　1.1 一般资料选取2012.6~2013.1河北联合大学附属医院妇科门诊就诊及健康体检的妇女为研究对象，分三组。RVVC组28例，VVC组30例，对照组30例。排除标准：妊娠妇女，合并BV、滴虫，近一个月使用阴道局部抗真菌药，血性分泌物。 　　诊断标准：VVC：初发或偶发，有典型体征，镜检见菌丝，真菌培养为假丝酵母菌；RVVC：VVC经治疗体征消失，真菌学查阴性后又出现症状，1年内发作4次及以上，真菌培养为假丝酵母菌；对照组为分泌物检查正常的妇女。 　　1.2 标本收集采集标本获患者知情同意。以3ml生理盐水冲洗阴道上段及宫颈，后穹窿处抽取灌洗液，3000转/分离心5min。收集于EP管，用于Elisa实验；沉淀细胞成分收集于另一EP管，用于提取脱落细胞总mRNA。标本于-20℃冻存。 　　1.3 试剂及仪器实验完成于河北联合大学实验中心。人源HBD-2、人源LL-37 Elisa试剂盒，两步法荧光定量反转录PCR试剂盒均购自广州绿色医药科技有限公司；RotorGene 3000 PCR仪，ELX800uv酶标仪，高速离心机，Q3000型微量分光光度计，引物由Invitrogen公司设计合成。 　　1.4 方法 　　1.4.1 按照Elisa试剂盒说明书操作，标准品蛋白浓度做纵坐标，标准品测OD值做横坐标，绘制标准曲线得到回归方程，计算标本蛋白浓度。 　　1.4.2 将阴道脱落细胞成分融化，加入1ml trizol冰上裂解，按说明书提取各标本总mRNA。及反转录合成cDNA，反应条件为42℃，50 min。cDNA冻存于-80℃冰箱。用PCR仪进行PCR扩增，扩增体系20μL。反应条件：95℃，15 s；59℃，25 s；共45个循环。实验结果应用分析软件Rotor-Gene计算出2-ΔΔCt值即各标本mRNA相对含量。 　　1.5 统计学方法使用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，总体分析采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。 　　2 结果 　　2.1 Elisa检测HBD-2、LL-37蛋白水平RVVC组的HBD-2、LL-37浓度较对照组明显降低（P＜0.05）；VVC组的HBD-2、LL-37含量较对照组均升高（P＜0.05）。以上差异均有统计学意义。见表1。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　2.2 HBD-2、LL-37 mRNA水平结果RVVC组阴道脱落细胞的HBD-2 mRNA、LL-37 mRNA的水平比正常对照组均明显降低（P＜0.01）；而VVC组阴道脱落细胞的HBD-2 mRNA水平较对照组升高（P＜0.05），LL-37 mRNA水平较正常对照组显著升高（P＜0.01）。见表2。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　3 讨论 　　阴道固有免疫系统是阴道抵抗外界各种病原的第一道防线，阴道粘膜分泌的抗微生物多肽是固有免疫系统的重要组成部分[3]，它是内源性、有抗菌活性的阳离子短肽，其主要包括防御素