慢病毒介导galectin 3基因沉默对垂体泌乳素腺瘤细胞的影响-effect of lentivirus-mediated galectin 3 gene silencing on pituitary prolactin adenoma cells.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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慢病毒介导galectin 3基因沉默对垂体泌乳素腺瘤细胞的影响-effect of lentivirus-mediated galectin 3 gene silencing on pituitary prolactin adenoma cells

摘要摘要目的：通过在泌乳素腺瘤细胞中对Galectin-3进行体外基因敲减，为治疗泌乳素腺瘤提供实验基础，为下一步体内进行垂体泌乳素腺瘤的Galectin-3基因敲除提供重要依据，初步探讨Galectin-3在泌乳素腺瘤的发生、发展中的作用机制。方法：1.泌乳素腺瘤细胞培养及激素水平的测定：选取经单鼻孔蝶窦入路手术切除的泌乳素腺瘤组织，采用悬浮细胞培养法，定时观察泌乳素腺瘤细胞的生长情况，并进行激素分泌功能测定。2.重组慢病毒载体介导Galectin-3基因沉默对泌乳素腺瘤细胞的影响的体外研究Galectin-3shRNA慢病毒载体（将其命名为LV-shRNA-Galectin-3）由上海吉凯技术有限公司包装制备。将培养的泌乳素腺瘤细胞进行实验分组，分为转染组（LV-shRNA-Galectin-3）,阴性对照组（为无关序列的发夹结构病毒载体,由上海吉凯基因提供）和空白对照组（未加任何质粒）。将慢病毒载体转染目的细胞，分别用Real-timePCR和Westernblot的方法检测慢病毒载体对Galectin-3的敲除效率，MTT法检测泌乳素腺瘤细胞的活力，确定LV-shRNA-Galectin-3介导的RNAi对泌乳素腺瘤细胞增殖及凋亡的影响。3.统计学方法实验数据采用SPSS16.0统计软件进行分析，各组之间的比较采用方差分析，两两组间比较采用SNK法。结果：1.泌乳素腺瘤细胞的培养及激素水平测定。相差倒置显微镜下观察，原代培养的泌乳素腺瘤细胞呈椭圆形或梭形，24h后有部分泌乳素腺瘤开始半贴壁生长，大部分呈悬浮生长。于培养的约第10天开始，成纤维细胞数量开始增多，并逐渐取代泌乳素腺瘤细胞。换下的培养液采用放射免疫方法检测。测定结果显示泌乳素腺瘤细胞分泌的激素水平在第7天左右最佳。2.shRNA在泌乳素腺瘤细胞中对Galectin-3敲减效率。Real-timePCR结果显示LV-shRNA-Galectin-3转染泌乳素腺瘤细胞后，其摘要Galectin-3的mRNA的表达比未敲减组降低了70%以上，p＜0.05，阴性对照组和空白组表达水平没有明显下降。WesternBlot检测结果显示，shRNA明显降低泌乳素腺瘤细胞中Galectin-3的蛋白表达，抑制效率达到70%以上，p＜0.05，而阴性对照组与空白组相比较，差异无统计学意义，p＞0.05。3.MTT法检测泌乳素腺瘤细胞的增殖能力。转染组与阴性对照组、空白对照组比较，组间差异具有统计学意义，p＜0.05。敲减Galectin-3能明显抑制细胞的增殖。结论：初步用慢病毒介导的Galectin-3基因沉默在体外敲减了垂体泌乳素腺瘤细胞的mRNA和蛋白，其细胞活力下降。Galectin-3在垂体腺瘤的发生及发展过程中有重要作用。【关键词】：Galectin-3PRL腺瘤慢病毒基因敲减AbstractAbstractObjective：WithGalectin-3geneknockdownintheprolactinomacellsinvitro,itprovideexperimentalbasisforthetreatmentofprolactinomasforthenextbodyprolactinomasandanimportantbasisforthepreliminaryexploretheGalectin-3intheoccurrenceofthemechanisminthedevelopmentofprolactinomas.Methods:Prolactinomacellcultureandhormonelevelsofmeasurement:selectthesurgicalremovalofprolactinomas,usingthesuspensioncellculture,regularobservationofthegrowthoftheprolactinomacells,andhormonesecretiondetermination.Theeffectsofprolactinomacellsbyrecombinantlentiviralvector-mediatedgenesilencingofGalectin-3invitro.Galectin-3-shRNAlentiviralvector(LV-shRNA-Galectin-3)PackagingbyShanghaiJiKaiTechnologyCo.,Ltd.Culturedprolactinomaprimarycellsaregrouped,dividedintoexperimentaldividedintotransferredgroup(LV-shRNA-Expressionof