慢病毒介导靶向沉默诱骗受体3(dcr3)在胰腺癌中诱导凋亡的实验研究-experimental study on slow virus-mediated targeting silencing decoy receptor 3 ( dcr 3 ) inducing apoptosis in pancreatic cancer.docx

慢病毒介导靶向沉默诱骗受体3（DcR3）在胰腺癌中诱导凋亡的实验研究中文摘要凋亡的影响和可能机制。方法实验细胞分为三组：LV-RNAi（细胞感染慢病毒干扰载体），LV-NC（细胞感染空病毒）和Control（未感染的细胞）。CCK8法(CellCountKit)检测细胞生长，克隆形成实验及EdU法(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化。对沉默DcR3的Panc-1细胞（LV-RNAi）和阴性对照组（LV-NC）进行基因芯片分析及RT-PCR、Westernblot验证。结果在FasL单独作用或单独沉默DcR3的情况下，细胞生长、细胞周期和凋亡与阴性对照组相比无明显变化（P＞0.05）。在FasL共培养下，CCK8检测发现LV-RNAi与LV-NC相比细胞生长受到抑制（P＜0.05），细胞克隆形成实验发现LV-RNAi的细胞克隆数少于LV-NC（P＜0.05），相对细胞克隆数减少36.3%，EdU实验发现Control组、LV-NC组和LV-RNAi组的细胞增殖阳性率分别为（69.8±5.93）%、（67.6±5.55）%和（39.2±3.83）%，LV-RNAi组的细胞增殖阳性率分别与另两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。三组细胞与sFasL（25ng/ml）共培养24h后，流式细胞术检测发现LV-RNAi细胞在G0/G1期分布比例明显增大（P＜0.05vs.LV-NC），S期无明显变化，处于G2/M期的细胞减少（P＜0.05vs.LV-NC），三组细胞凋亡率分别为5.7±0.86%、4.6±0.73%和12.8±1.62%，LV-RNAi与其他两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。在mFasL的作用下，LV-RNAi的细胞在G0/G1期分布比例增大，G2/M期减少，分别与control组（+mFasL）和LV-NC组（+mFasL）相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞仪检测细胞早期凋亡发现：Control、LV-NC和LV-RNAi在mFasL的作用下凋亡率分别为3.2±0.35%、2.8±0.26%和11.1±1.49%，LV-RNAi组与其他两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。25ng/ml的sFasL处理LV-RNAi和LV-NC24h后，通过表达谱基因芯片检测和GeneOntology分析发现LV-RNAi整体上起到了调控凋亡信号传导通路，诱导凋亡和调控G1→S期的关卡，使细胞周期停滞在G0/G1期的作用。RT-PCR发现FADD、Caspase3和Caspase8在LV-RNAi组的表达均明显增强，与Control组和LV-NC组相比差异有统计学意义（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01），且差异倍数和芯片检测基本一致。Westernblot检测发现发现单纯沉默DcR3，pERK的相对表达量（pERK/ERK）并无统计学差异（P＞0.05），而在sFasL的作用下，抑制DcR3的表达可减少pERK中文摘要慢病毒介导靶向沉默诱骗受体3（DcR3）在胰腺癌中诱导凋亡的实验研究的表达（P＜0.05,LV-RNAivs.LV-NC）。结论胰腺癌Panc-1细胞对FasL/Fas介导的凋亡不敏感。靶向沉默DcR3基因可以有效恢复FasL/Fas的作用，抑制细胞恶性增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，FADD、Caspase3、Caspase8和pERK参与DcR3沉默后FasL介导的凋亡过程。第五部分靶向沉默DcR3对胰腺癌移植瘤抑制作用的体内实验目的在动物体内观察靶向沉默DcR3的基因治疗对胰腺癌的作用。方法分别建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤模型，分组干预治疗，IHC验证基因沉默效果。在皮下移植瘤模型中，观察瘤块生长情况，TUNEL和电镜检测凋亡。在原位移植瘤模型中，观察肿瘤浸润转移情况，并进行生存分析。结果IHC检测发现基因沉默治疗后DcR3蛋白表达明显减少（P＜0.05）。基因治疗沉默DcR3后，裸鼠皮下瘤的体积和质量均小于LV-NC组（P＜0.05；P＜0.05）。TUNEL检测发现LV-RNAi组肿瘤中凋亡细胞增多（P＜0.05）。透射电镜下观察到Control组和LV-NC组肿瘤细胞饱满，常染色质存在，异染色质呈颗粒状，核仁呈网状表明核增殖功能旺盛。LV-RNAi组肿瘤细胞出现凋亡细胞特征：细胞体积变小，细胞间连接消失，细胞核内异染色质增多并边集，凝聚在核膜下。原位移植瘤裸鼠在基因治疗后浸润和转移情况有所好转，生存分析发现LV-RNAi组裸鼠荷瘤生存时间较LV-NC延长（P＜0.05）。结论靶向沉默DcR3基因后可以通过沉默移植瘤内DcR3的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，延长裸鼠荷瘤生存时间。关键词：诱骗受体3；凋亡；