慢病毒载体介导的npm1基因沉默对hl-60 k562细胞及其耐药细胞株的作用分析-effect of lentiviral vector-mediated np m1 gene silencing on hl - 60 k562 cells and their drug-resistant cell lines.docxVIP

PAGE PAGE 3 慢病毒载体介导的 NPM1 基因沉默对 HL-60、K562 细胞及其耐药细胞株的作用研究 摘 要 白血病是一类起源于造血干细胞的克隆性恶性疾病，其发生和发展与多种遗 传学改变密切相关，但是迄今为止确切的发病机制尚不清楚。治疗方法以化疗为 主，但是化疗过程中发生耐药或在完全缓解后复发白血病依然是大多数白血病治 疗失败的主要原因。近 20 年来，随着细胞遗传学和分子生物学技术的应用和发 展，一系列与白血病发生、发展及预后相关的基因、受体、细胞内关键物质等相 继被发现，使得分子水平的靶向治疗以及以这些靶向为目标的新型药物的研发日 益成为研究的热点。 核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin，NPM，B23）是主要位于核仁颗粒区的一 种多功能蛋白。它可以直接参与核糖体的合成、中心体的复制，同时还可作为蛋 白和核酸的分子伴侣，因此，在细胞的生命活动中发挥重要作用。NPM 基因异 常可导致细胞恶性增殖和抵抗凋亡，是导致肿瘤细胞恶性转化的重要机制。近年 来的多项研究表明，多种实体肿瘤细胞高表达 NPM，有学者提出 NPM 可作为肝 细胞癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌等恶性肿瘤的分子标志物。在血液肿 瘤方面的研究发现，NPM 基因突变与原发性急性髓系白血病（AML）密切相关， 它可出现在 AML 的各亚型中（M3 除外），主要累及染色体核型正常的患者。NPM 与白血病的发生、发展、预后密切相关，但确切的机制尚未阐明。核仁素 （Nucleolin，C23）是一种含量最多的核仁蛋白质，它也是一种多功能蛋白，能 调控核糖体的生物合成、细胞增殖、染色质复制与核仁的发生等过程。此外，核 仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关。 RNA 干扰(RNAi)，是由双链 RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异 性基因沉默，具有高效、特异的特点。应用 RNAi 技术有助于研究某些白血病相 关基因的功能，同时也为基因治疗提供了一个新的重要技术。 方法：本课题研究首先应用蛋白质组学技术对 HL-60 及其耐阿霉素 HL-60/ADR 细胞进行蛋白表达谱的分析，挑取其中差异倍数较大的两种蛋白 ( B23 和 C23)进行原代白血病细胞的验证，并采用 RNA 干扰技术，构建 NPM1-RNAi 载体，特异性沉默 NPM1 基因的表达，并以 HL-60 及其耐阿霉素细 胞株（HL-60/ADR）、K562 及其耐阿霉素细胞株（K562/A02）、K562 耐伊马替 尼细胞株(K562/G01)为研究对象，观察 NPM1 基因沉默对它们的生物学特性的影 响。 结果：1．运用蛋白质组学技术对 HL-60 细胞和耐阿霉素的 HL-60/ADR 细 胞的整体蛋白表达谱进行了比较，共发现 18 个表达差异蛋白点，其中 13 个蛋白 在耐阿霉素的 HL-60/ADR 细胞中表达显著上调，3 个蛋白表达显著下调，从功 能上看它们主要是与蛋白质合成、信号转导、DNA 修复、分子伴侣、转录因子 有关的蛋白质。 2．在上述的差异蛋白点中挑取具有统计学意义的（p0.05）差异倍数较大的 两种蛋白进行白血病细胞株和原代白血病细胞的表达水平的验证。结果发现， B23 和 C23 蛋白在多种白血病细胞株中高表达，特别是在耐药细胞株中的表达水 平较之相应的亲本细胞株明显增高。 3．在急性白血病（AL）中，与正常对照组不表达或弱表达相比较，初治的 AL 病例表达 B23+/C23+为 42.5%，复发和难治的患者中表达更高（分别为 68.8%， 76.5%），且 B23+/C23+患者的 OS 和 RFS 与 B23-/C23-相比较明显缩短。 4．B23 和 C23 蛋白在慢性粒细胞白血病（CML）慢性期和加速期患者中呈 低表达(B23+/C23+分别为 9.1%，8.3%)，在急变期患者中呈高表达(81.0%)，两者 的差别具有统计学意义（p0.05），因此值得进一步探讨 B23 和 C23 蛋白作为慢 粒分期的参考指标的可能性。 5．NPM mRNA 在多种白血病细胞株中高表达，特别是在耐药细胞株和复发 和难治的 AL 患者以及 CML 急变期患者中表达水平更高。 6．成功构建了 pGCSIL-GFP-NPM1 RNAi 载体。 7．应用慢病毒载体介导的方法，将 NPM1-RNAi-LV 转染了 HL-60 细胞、耐 阿霉素的 HL-60/ADR 细胞、K562 细胞、耐阿霉素的 K562/A02 细胞以及耐伊马 替尼的 K562/G01 细胞，经实时定量 RT-PCR 检测发现转染细胞的 NPM1 基因敲 减效率达到 90%以上(P0.05)。Western blot 的结果显示转染细胞的 B23 蛋白水平 明显下调，说明成功的构建了上述