麻花艽gentiana straminea和大叶秦艽gentiana macrophylla细胞培养研究-study on cell culture of gentiana stram inea and gentiana macrophlla of gentiana macrophylla.docxVIP

万方数据 万方数据 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权青海大 学大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于：保密□不保密□（请在相应方框内 打“√”），在 年解密后适用本授权书。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 摘要 摘要 摘 要 麻花艽（Gentiana straminea Maxim）和大叶秦艽（Gentiana macrophylla Pall） 属龙胆科龙胆属，为多年生草本植物，是我国传统常用中药材。其以根和花入药， 多产于西藏、青海、陕西、甘肃、四川等地。近年来，由于临床用药量的增加和 过度采挖，致使麻花艽和大叶秦艽野生资源日趋减少。因此，开展麻花艽和大叶 秦艽的细胞工程研究则显得尤为重要。为此，本研究以麻花艽和大叶秦艽为试验 材料，从愈伤组织和悬浮细胞两个方面开展这两种植物的细胞培养研究，并研究 细胞培养过程中龙胆苦苷含量的变化，旨在为通过细胞培养来生产次生代谢产物 奠定技术基础。 主要研究结果如下： 1. 以麻花艽无菌苗叶片为外植体，以 MS 为基本培养基，附加 2.0 mg·L-1 2,4-D 和 0.5 mg·L-1 6-BA，添加 0.85%的琼脂，适于愈伤组织的诱导，其最高诱 导率为 90.6%。 2. 以大叶秦艽无菌苗叶片为外植体，以 MS 为基本培养基，附加 1.5 mg·L-1 2,4-D 和 0.5 mg·L-1 6-BA，添加 0.85%的琼脂，适于愈伤组织的诱导，其最高诱 导率为 87.7%。 3. 开展了麻花艽愈伤组织培养的研究。麻花艽愈伤组织的生长曲线呈“S” 型，生长周期为33 d，可分为4个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退 期；每一时期的细胞分裂指数分别为22.18 %、54.23%、67.55% 和26.97%，各时 期对应的龙胆苦苷含量分别为7.92、15.01、25.02和14.04 mg·g-1 DW。龙胆苦苷 的积累与愈伤组织的增殖呈同步趋势，在稳定期达到最大值。 4. 开展了大叶秦艽愈伤组织培养的研究。大叶秦艽愈伤组织的生长曲线呈 “S”型，生长周期为33 d，可分为4个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰 退期；每一时期的细胞分裂指数分别为25.54%、47.09 %、63.56%和34.15 %，各 时期对应的龙胆苦苷含量分别为11.80、16.38、22.49和8.79 mg·g-1 DW。龙胆苦 苷的积累与愈伤组织的增殖呈同步趋势，在稳定期达到最大值。 5. 对麻花艽和大叶秦艽不同生长时期愈伤组织细胞的形态结构进行了观 察。延滞期细胞较小，近球形；对数生长期细胞近等边形，胞质浓厚，细胞分裂 旺盛；稳定期细胞开始变长；衰退期细胞基本呈长条形。随着细胞的生长，质体 逐渐发育成熟，到了衰退期，质体开始解体。 6. 通过对初始接种量、蔗糖浓度、摇床转速、温度、基本培养基及诱导子 I 的优化，开展了麻花艽的细胞悬浮培养研究。以MS为基本培养基、初始接种量 为30 g·L-1、蔗糖浓度3%、摇床转速110 r·min-1、温度22℃以及加入100 mg·L-1的 酵母膏或5 g·L-1的果糖，有利于麻花艽悬浮细胞的生长及龙胆苦苷的合成。 7. 通过对初始接种量、蔗糖浓度、摇床转速、温度、基本培养基及诱导子 的优化，开展了大叶秦艽的细胞悬浮培养研究。以MS为基本培养基、初始接种 量为20 g·L-1、蔗糖浓度3.5%、摇床转速110 r·min-1、温度22℃以及加入100 mg·L-1 的水解酪蛋白或5 g·L-1的果糖，有利于大叶秦艽悬浮细胞的生长及龙胆苦苷的合 成。 8. 在麻花艽细胞悬浮培养的最优条件下，研究了细胞悬浮培养过程中龙胆 苦苷含量的变化。麻花艽悬浮细胞的生长曲线呈“S”型，生长周期为 30 d，可分 为 4 个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。各时期细胞内龙胆苦苷 含量分别为 16.53、20.14、23.86 和 14.63 mg·g-1 DW，释放到培养液中龙胆苦苷 含量分别为 5.22、7.97、9.11、11.10 mg·g-