苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(acmnpv)pk-1基因的克隆与表达-cloning and expression of pk - 1 gene of nuclear polyhedrosis virus ( acm npv ) from spodoptera exigua.docxVIP

目 录 1 引言1 1.1 昆虫杆状病毒的简介1 1.1.1 昆虫杆状病毒的来源1 1.1.2 昆虫杆状病毒的分类1 1.1.3 昆虫杆状病毒的应用1 1.2 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(ACMNPV)的简介 3 1.3 蛋白激酶的简介3 1.3.1 丝/苏氨酸蛋白激酶的来源3 1.3.2 丝/苏氨酸蛋白激酶在生物体中的功能4 1.3.3 丝/苏氨酸蛋白激酶与肿瘤的关系6 1.4 PK-1 基因及其磷酸化作用的研究进展 6 HYPERLINK \l _bookmark0 1.5 本实验的目的与意义7 1.6 本实验的技术路线8 2 材料与方法9 2.1 材料与实验设备9 2.1.1 质粒和感受态9 2.1.2 细胞和病毒来源9 2.1.3 需要的酶和试剂、溶液9 2.1.4 仪器及设备11 2.1.5 培养基11 2.2 实验方法12 2.2.1 PK-1 基因的克隆 12 2.2.2 PK-1 基因的原核表达 16 2.2.3 PK-1 基因的真核表达 18 2.2.4 真核表达 PK-1 产物 WESTERN BLOT 检测 20 3 结果与分析21 3.1 目的片段的 PCR 扩增 21 3.2 重组质粒的酶切鉴定22 3.3 构建重组质粒的测序结果分析23 3.4 PK-1 目的蛋白的表达、鉴定及纯化 26 3.4.1 GST-TAG PK-1 目的蛋白的表达纯化 26 3.4.2 HIS-TAG PK-1 目的蛋白的表达纯化 26 3.4.3 FLAG-TAG PK-1 目的蛋白的表达纯化 27 3.4.4 PK-1 目的蛋白的免疫印迹鉴定 28 4 讨论28 5 结论29 致 谢 31 参 考 文 献 32 作 者 简 介 36 插图和 插图和附表清单 1. 图 1 实验流程图 8 2. HYPERLINK \l _bookmark1 图 2 pk-1/pGEX4T1 重组质粒图谱 12 3. HYPERLINK \l _bookmark1 图 3 pk-1/pET30a 重组质粒图谱 13 4. 图 4 昆虫杆状病毒 AcMNPV pk-1 基因 PCR 扩增结果 22 5. 图 5 pk-1/pGEX4T1 重组质粒的酶切鉴定 23 6. 图 6 pk-1/pET30a 重组质粒的酶切鉴定 23 7. 图 7 pk-1/pFast HF Tb 重组质粒的酶切鉴定 24 8. 图 8 pk-1 测序结果的序列比对 24 9. 图 9 Pk-1 氨基酸序列 25 10. 图 10 带有 GST 标签的 Pk-1 蛋白 SDS电泳 25 11. 图 11 带有 His 标签的 Pk-1 蛋白 SDS电泳 26 12. 图 12 带有 Flag 标签的 Pk-1 蛋白 SDS电泳 27 13. 图 13 真核表达的 Pk-1 蛋白免疫印迹鉴定 28 13. 表 1 pk-1 引物序列 13 14. 表 2 PCR 扩增的反应体系 13 15. 表 3 双酶切反应体系 14 16. 表 4 连接反应体系 15 17. 表 5 重组质粒酶切鉴定反应体系 16 18. 表 6 SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶配方 18 19. 表 7 SDS聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方 18 缩略语表 缩 略 语 表 bp（base pair） 碱基对 kDa（kilodalton） 千道尔顿 PK（Protein kinase） 蛋白激酶 Tris （Tri(hydroxymethyl)aminomet-hane） 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐 SDS（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）十二烷基硫 酸钠凝胶电泳 X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖 苷 IPTG （Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside） 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 AMP（Ampicillin） 氨苄青霉素 Kan（Kanamycin sulfate）