脾源性炎症反应在重型颅脑损伤大鼠中的作用及机制分析-effect and mechanism of splenic inflammatory response in rats with severe craniocerebral injury.docx

脾源性炎症反应在重型颅脑损伤大鼠中的作用及机制研究摘要背景和目的近年来，各种原因造成的创伤性脑损伤（traumaticbraininjury，TBI）有逐年增加的趋势。重型颅脑损伤患者约占全部脑损伤的20%左右，其死亡率高达20~50%，已经成为青少年致死、致残的首要原因，为家庭和社会带来的沉重的经济负担和精神痛苦。研究如何提高重型颅脑损伤患者的救治效果具有重要的意义。TBI包括原发性和继发性脑损伤。继发性脑损伤是指伤后逐渐形成的损伤；颅脑损伤后血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB）的破坏、小胶质细胞激活、细胞因子和趋化因子等的释放、白细胞及巨噬细胞的侵润等共同参与和促进了继发性脑损伤的形成，往往造成难以控制的创伤性脑水肿，是重型颅脑损伤患者死亡的首要原因。目前有关TBI后创伤性脑水肿形成的机制研究多集中在脑组织局部，而机体外周组织器官对继发性脑损伤的作用尚不清楚。有研究表明，TBI尤其是重型颅脑损伤后机体常伴发全身炎症反应综合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS），是免疫系统被过度激活的结果，伴有多种炎症介质的表达增加，如白介素1β（interleukin1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）、IL-6等，而这些细胞因子在继发性脑损伤的病理过程中也有重要作用。脾脏是人体最大的免疫器官，含有多种免疫活性细胞，在应激下能够释放多种炎症介质，同时也是SIRS发生的重要效应器官。因此我们推测，TBI后脾脏的免疫功能被激活，免疫活性细胞及大量促炎因子通过破坏的BBB而到达创伤区域脑组织，进一步促进脑组织局部的炎症反应，加重创伤性脑水肿的程度。为了验证上述假设，本研究分三部分进行，第一部分建立重型颅脑损伤大鼠模型，观察TBI后立即行脾脏切除对大鼠死亡率及脑组织含水量及大鼠认知功能的影响；第二部分检测了TBI后脾脏内炎症因子的表达以及脾脏切除对大鼠TBI后血液及脑组织局部炎症因子表达的影响；第三部分检测了脾脏切除对重型颅脑损伤大鼠创伤区域脑组织MAPK信号通路主要分子表达的影响，并通过体外培养大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞（代替神经元）、小鼠源性小胶质细胞系BV-2细胞，检测了脑创伤大鼠脾脏上清对PC12细胞凋亡的影响以及对BV-2细胞MAPK-NF-κB通路的影响，进一步明确脾脏在TBI后创伤性脑水肿形成的作用和机制。材料和方法整个研究包括在体和离体实验。在体实验建立了SD大鼠重型颅脑损伤模，并观察脾脏切除对外周及脑组织炎症反应水平的影响；离体实验以大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12模拟神经元，培养BV-2小胶质细胞，并观察TBI大鼠脾脏对其的作用及具体机制。1.应用Feeney法建立SD大鼠重型颅脑损伤模型；2.将SD大鼠分为Sham（假手术组），TBI（重型颅脑损伤组），以及TBISPX（重型颅脑损伤后立即行脾脏切除）三组，分别测定大鼠脑组织含水量以及死亡率；3.应用Morris水迷宫定位航行试验和空间搜索试验检测Sham、TBI、及TBISPX三组内大鼠的认知功能；4.ELISA法检测重型颅脑损伤大鼠伤后不同时间脾脏内IL-1β和TNF-α的浓度变化；5.ELISA法检测Sham、TBI、及TBISPX三组内大鼠伤后不同时间血清中IL-1β、TNF-α、IL-6以及IL-10水平；6.荧光定量RT-PCR检测Sham、TBI、及TBISPX三组内大鼠伤后不同时间致伤处脑组织IL-1β、TNF-α、IL-6以及IL-10的mRNA表达水平；7.Westernblot法检测Sham、TBI、及TBISPX三组大鼠脑组织内p38MAPK、ERK、PI3K以及NF-κB表达的影响；8.以PC12细胞体外模拟神经元，流式细胞术检测重型颅脑损伤大鼠脾脏上清液对其凋亡率的影响；9.应用Westernblot检测重型颅脑损伤大鼠脾脏上清对体外培养BV-2小胶质细胞内p38MAPK、ERK以及JNK的表达变化；激光共聚焦检测脾脏上清对BV-2细胞内NF-κB激活的影响。结果1.SD大鼠颅脑损伤后死亡率为35.42%，与人类重型颅脑损伤后死亡率基本相符；2.脑创伤后行脾脏切除能够显著降低SD大鼠的死亡率，并且能够缓解伤后早期脑组织水肿的程度；3.重型颅脑损伤大鼠伤后立即行脾脏切除能够有效地改善大鼠的认知功能和学习能力；4.重型颅脑损伤后脾脏能够释放大量IL-1β和TNF-α，其中TNF-α反应迅速，伤后短时间内（3h）即显著增高；5.脾脏切除能够有效地降低重型颅脑损伤大鼠伤后血浆中IL-1β、TNF-α以及IL-6的含量，并且能够显著降低致伤区域脑组织IL-1β、TNF-α以及IL-6的mRNA水平；6.脾脏切除能够有效地降低重型颅脑