伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力和e.coli体内生物膜形成的影响-effects of salmonella typhi plasmid on bacterial virulence and biofilm formation in e coli under different conditions.docxVIP

中文摘要目的：在自然界细菌以单个游离悬浮状态和生物膜（biofilm，BF）状态两种形式存在。与浮游细菌相比，处于BF状态的细菌对不利条件，如干燥、极端温度、抗菌药物和消毒剂的抵抗力均明显增强。感染了BF的机体和污染了BF的生物材料，即使应用正常剂量数百倍的抗菌药物也难以奏效，因而常导致迁延难治性感染或严重公共卫生事件。伤寒沙门菌质粒pRST98是一种同时编码细菌耐药性和毒力的“嵌合性”质粒，在实验室和小鼠体内很容易通过接合作用从伤寒沙门菌（Salmonellatyphi,S.typhi,ST）传递至鼠伤寒沙门菌（Salmonellatyphimurium,S.typhimurium,STM）、大肠埃希菌（Escherichiacoli,E.coli）和痢疾杆菌等，且这些细菌彼此之间还可互相传递，导致宿主菌耐药性和毒力增强。由于伤寒沙门菌只感染人类，没有合适的动物模型，因此在本课题中，通过接合转移将pRST98分别转移至受体菌形成接合子STM/pRST98和E.coli/pRST98进行研究。本研究第一部分探讨伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响，比较受试菌STM，STM/pRST98，E.coli和E.coli/pRST98在浮游状态和BF状态下，细菌粘附侵袭、抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬能力的的差异。本研究第二部分以E.coli和E.coli/pRST98为研究对象，通过构建小鼠泌尿道插管模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98对E.coli在小鼠体内形成BF的影响。方法：一、伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响1.不同状态下细菌菌液的准备按常规方法将受试菌STM,STM/pRST98,E.coli和E.coli/pRST98增菌，制备单个游离悬浮状态的细菌菌液；将受试菌分别在常规条件下培养3d形成成熟BF，使用超声法将BF中的细菌均匀分散后，制备BF状态下的菌液。将游离细菌与BF细菌使用OD法和平板菌落计数法（colony-formingunit,CFU）确定浓度后，分别与小鼠结肠癌细胞CT26进行粘附侵袭、血清杀菌以及抗巨噬细胞吞噬实验，分别比较不同状态下受试菌毒力的差异以及pRST98对不同状态下宿主菌毒力的影响。2.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌粘附和侵袭CT26细胞的影响将实验菌株STM,STM/pRST98,E.coli和E.coli/pRST98按感染复数（multiplicityofinfection,MOI）100:1与CT26细胞共培养1h后，弃去菌液后用PBS洗涤细胞，破膜后用CFU比较受试菌对细胞的粘附力。侵袭实验与粘附实验基本相同，但在细菌细胞共培养1h后弃去菌液用PBS洗涤3次后每孔加入含阿米卡星（100μg/ml）的细胞培养液，作用3h后进行细胞内活菌计数。3.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗血清杀菌能力的影响用OD法和CFU法将不同状态的受试菌稀释至1×104CFU/ml，吸取20μl菌液分别加入含不同稀释度的兔和豚鼠血清0.2ml的试管，不含血清的普通肉汤管做CFU对照，根据预实验结果选择37℃，2h作为杀菌作用时间。用平板菌落计数法计算存活细菌数。4.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗巨噬细胞吞噬杀伤的影响STM作为兼性厌氧胞内菌，可在巨噬细胞内存活。用OD法和CFU法将浮游状态和BF状态下受试菌浓度调整至107CFU/ml待用。用血细胞计数板计数后将小鼠巨噬细胞J774A.1细胞浓度调整至5×105个/ml，分别加入6孔板，每孔1ml。将1ml不同状态的受试菌加入到各孔中，与细胞共作用1h。用含阿米卡星（100μg/ml）的RPMI1640培养液离心洗涤除去胞外菌，重新悬浮于含阿米卡星的培养液中，在不同时间点裂解细胞做CFU检测胞内活菌数。二、伤寒沙门菌质粒对E.coli体内生物膜形成的影响1.小鼠泌尿道插管模型的制备PE10塑料导管经消毒处理后分别于1×107CFU/ml的E.coli和E.coli/pRST98菌液中浸润24h，使受试菌粘附于导管表面。雌鼠进行麻醉、固定及消毒后，将准备好的PE10导管插入小鼠尿道并轻推至膀胱中。根据感染细菌的不同将小鼠分为两组，每组6只，实验重复3次。2.比较E.coli和E.coli/pRST98在体内形成BF的差异（1）激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）观察导管表面BF的形成感染后第5d小鼠经麻醉处死，将PE10导管从体内取出后用PBS洗涤，置于适量浓度为0.01%的吖啶橙染液中，于黑暗中静置染色10min再用PBS洗涤，将染色的导管置于载玻片上镜下观察。扫描电镜（Scanningelectronmicroscopy,SEM）观察导管表面生物膜的形成将插管后第5天的小鼠麻醉后处死