基因工程重组体克隆的筛选和鉴定课件.pptVIP

;第七章 重组体克隆的筛选和鉴定;一、抗药性标记及其插入失活选择法;pBR322;（1）四环素：;3. 选择过程：;;（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;抗药性标记选择应注意的问题;二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法;2. 选择过程;;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;二、酶切电泳筛选法;;;不同克隆的酶切结果;插入片段;三、PCR扩增检测法;1. 核酸杂交;二、核酸杂交检测方法;;Southern blot 筛选结果;（1）原位杂交筛选;;（2）R-环检测法;;2. Northern blotting;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;2. 放射性抗体检测法过程;3. Broome-Gilbert双位点检测法;;二、免疫沉淀检测法;;三、酶联免疫吸附测定（ELISA）;;2. ELISA检测的一般步骤;加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;;在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。;3.ELISA的局限性;临床检验常用的单抗;四、免疫印迹（western