水泡性口炎病毒新型突变株的构建及毒性的分析-construction of a new mutant of vesicular stomatitis virus and analysis of its toxicity.docxVIP

浙江理工大学硕士学位论文水泡性口炎病毒新型突 浙江理工大学硕士学位论文 水泡性口炎病毒新型突变株的构建及毒性的研究 万方数据 万方数据 摘要 弱毒疫苗和灭活疫苗是目前人和动物传染病预防的两种最主要方式。利用弱化的活病 毒作为载体表达外源抗原，可高效而全面地激发机体免疫应答，是有前途的疫苗研制方式。 水泡性口炎病毒（VSV）是一种良好的病毒载体，动物体内的研究表明，表达外源蛋 白的重组 VSV 病毒可有效激发机体体液免疫和细胞免疫，提供较全面和持久的保护。然 而，目前制约 VSV 载体进入实际应用的一个关键问题是其安全性，试验表明，在高剂量 接种 VSV 后，小鼠可表现出神经毒性，出现诸如后肢麻痹等症状，因此，野生型的 VSV 疫苗载体仍然需要进一步地改造，以提高其使用的安全性。 M 蛋白作为 VSV 的重要毒力因子，与 VSV 的致病性形成密切相关，有研究表明： 自然情况下，存在一种 VSV 突变体，其 M 蛋白上第 51 位氨基酸（甲硫氨酸）突变为精 氨酸，这种突变型 VSV 的致病性减低。目前研究的一个不足是，对 VSV 致病机理及 M 蛋白在其中意义的研究数据几乎完全来源于小鼠。 猪是 VSV 的天然宿主之一，本试验研究了 M 蛋白第 51 位氨基酸发生缺失的重组水 泡性口炎病毒（VSVΔM51）对猪的致病性和免疫原性。结果表明，相比野生型 VSV，接 种 VSVΔM51 后动物临床症状明显减轻；抗体中和的检测显示，VSVΔM51 可有效地激发 本体动物的免疫应答，有希望成为一个有效的预防猪 VSV 的候选疫苗载体。 由于 VSVΔM51 仍然具有一定毒性，利用重组 DNA 技术，本试验又构建了 M 蛋白 三位点发生突变的新型重组 VSV 病毒（VSV-MT），突变的位点包括：M 蛋白第 51，221 位和 226 位氨基酸。在此基础上，本试验对新病毒进行了体外和体内生物学特性的鉴定， 包括体外病毒多步生长曲线，病毒在动物体内的致病性和免疫原性等。体外病毒多步生长 曲线结果表明，VSV-MT 的增殖能力显著弱于野生型 VSV 病毒（VSVXN2）。体内实验中， 以体重变化和组织病毒载量等为指标，较之野生型 VSV 病毒和 VSVΔM51 病毒，VSV-MT 显著弱化。 病毒在毒性弱化后，通常会出现免疫原性的减弱，因此，本试验对弱化的 VSV-MT 的接种动物的免疫保护力进行了测定。VSV-MT 在小鼠中进行的实验表明，不同剂量的 VSV-MT 接种动物后，动物体内可产生较高水平的中和抗体，免疫动物 21 d 后，对各免 疫剂量组的动物用野生强毒攻击，动物未出现死亡、显著的体重下降等症状。 关键词：水泡性口炎病毒、病毒载体、基质蛋白、致病性、免疫原性 I Abstract Presently, attenuated and inactivated pathogens are commonly applied for developing vaccines. Many attenuated viruses has been used to express foreign antigens which can stimulate efficient and comprehensive immunue responses in vivo,and can be a promising method for vaccine development. Vesicular stomatitis virus (VSV) is an excellent viral vector. In vivo studies indicated that HYPERLINK /w/recombinant/ recombinant VSV can stimulate both humoral immunity and cellular immunity, which induce comprehensive andLasting protection for animals. However, there still exist toxicities with HYPERLINK /w/recombinant/ recombinant VSVs in animals. Inoculated with high doses of VSV, neurotoxicity including hindLimg paralysis appeared in BALB/c mice. Therefore, VSV still need to be attenuated due to its toxicities in animals. Protein M is