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片段的分离和回收质粒DNA的连接和转化ppt课件
实验五;第一部分 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 ;实验目的：;DNA片段分离回收常用方法：;电洗脱法;低熔点琼脂糖凝胶法;DEAE滤膜插片法;玻璃奶法 ;实验原理：;DNA 结合率影响因素：;应 用：;本方法的优点：;实验材料： ;方法和步骤：; ;5．涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads，加入10 μl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50～55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴过程中，每隔2 min震荡EP管悬浮Ultra-Sep Beads。 注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的产量将会显著减少。如果混合物变为橙色或红色，则加入5 μl 5M NaAC（pH5.2）以降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该变为淡黄色。
;;9．弃上清并彻底去除离心管残余液体。空气中干燥5～10min。
10．向管中加入15～50 μl（按最终产物浓度确定加入体积）Elution Buffer（10mM Tris，pH8.5）。涡旋震荡重悬沉淀，50℃水浴5min，10,000×g离心1min，沉淀玻璃奶。
如果用水洗脱DNA，确定水的pH值在7.5～8.0之间。
11．小心将上清转入另一EP管中，上清即含纯DNA。约80～90%结合DNA被洗脱下来。;12. DNA产量和质量测定：
适当稀释DNA，测定A260及A280。按照计算公式计算DNA浓度：
DNA浓度=吸光度260x50x稀释倍数mg/ml
DNA纯度=A260/A280, ＞1.8表明样品核酸纯度＞90%。;注意事项： ;第二部分 质粒DNA的连接和转化;实验目的;一、DNA分子的体外连接;实验原理;;DNA连接酶;T7 DNA ligase;注意事项;提高连接效率的方法：;提高连接效率的方法：;;实验材料：;方法和步骤 ; 二、重组DNA的转化及转化子的筛选;实验原理:;质粒DNA转化大肠杆菌：;感受态细胞能接受外来DNA 分子的机制;转化子的筛选方法：;常用方法：;X-gal + IPTG + AMP;实验材料 ;感受态细胞制备;转 化 ;注 意 事 项;;实验五思考题：
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