生物学第八讲 PCR及其衍生技术在动物传染病防制中的应用ppt课件.pptVIP

第八讲 PCR及其在疾病防制中的应用; 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）又称体外核酸扩增技术，是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模拟天然DNA的复制过程，在附加的一对引物之间诱发重复的聚合酶反应。PCR包括DNA模板的变性（denaturation）、引物退火（annealing）及多核甘酸链的延伸（extension）等三个步骤组成的多次重复循环，使末端被引物5′端限定的微量特异性DNA片段成指数形式积累。通过PCR，可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核甘酸片段。 ; PCR于1983年由美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等发明，1985年由Saiki等在Science杂志上公开报道，1987年获得专利，Kary Mullis因此获得1993年诺贝尔化学奖。; 聚合酶链反应将靶DNA作为模板，与模板片段两端已知的3′序列互补的两种寡核苷酸为引物，经过模板DNA变性、模板与引物退火结合以及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸，合成与模板链互补的新DNA链。 目的基因的扩增是依据体内DNA的复制过程设计的。根据时间和温度，一个PCR循环可分为三步反应。; 第一步，高温（94~95℃）变性，高温使模板DNA双链间氢键断裂而解离形成两条单链（高温变性后突然降温，以保持单链形式）；第二步，低温（55～56℃）退火，退火使特异性引物寡核苷酸片段按碱基配对规则与变性的单链DNA模板上的相应互补区配对结合（当然，同时也存在两条模板链之间的结合，但由于引物有高浓度、结构简单等特点，所以退火主要发生在模板与引物之间）；第三步,中温（72℃）延伸，在4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）底物和Mg2+存在的条件下，从引物的3′端开始，由DNA聚合酶催化合成与模板链互补的新DNA链。; 每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板。由于扩增中碱基排列顺序由靶DNA决定，因此PCR的扩增具有高度特异性。经n次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，理论值应是2n。PCR扩增能力是十分惊人的，理论上经过30次的循环反应，可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106～107倍的扩增。扩增产物可通过凝胶电泳、Southern印迹杂交或DNA序列分析等进行检测。;图9－1 PCR原理示意图; （一）DNA聚合酶 聚合酶是一种利用一段既成的脱氧核糖核酸或核糖核酸作为核酸模板，催化脱氧核糖核酸或核糖核酸生成多聚核苷酸的酶。DNA聚合酶的作用是将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，且不发生解离。分子生物学中经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片断酶（Klenow 酶）、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶以及反转录酶等。 ; 早期PCR存在的问题是，使DNA变性的温度也能使DNA聚合酶变性。1976年 ，Chien分离出热稳定性聚合酶。1986年 ，Erlich从一种 生活在温度高达75℃的热泉中的栖热水生菌（Thermus aquatcus）中分离纯化出适于PCR的热稳定DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶。 Saiki等人于1988年成功地将热稳定的TaqDNA聚合酶应用于PCR扩增，使PCR实现了自动化。 ; 在加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中，TaqDNA聚合酶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，以结合在扩增区段两端引物3′端为起点，按5′→3′的方向合成新生互补链（TaqDNA聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性，而缺乏3′→5′核酸外切酶活性）。这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需求。 ; TaqDNA聚合酶的最适温度为75～80℃，每个酶分子合成速率约为150个核苷酸/s，即使在70℃，延伸速率亦可达到60个核苷酸以上。一般情况下，PCR选择72℃作为延伸温度。 纯化的TaqDNA聚合酶在体外无3′→5′外切核酸酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程中可引起错配。其在复制DNA过程中错误掺入核苷酸的比率为1/7500。当采用低浓度的dNTP（各20μmol/L）、1.5mmol/LMg2+及复性温度高于55℃时，可提高酶的专一性，降低合成的错配率。另外也可以将其与具有3′→5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶联用，