苹果主栽品种β-13-葡聚糖酶基因转化及抗病性状检测-transformation of β - 13 - glucanase gene and detection of disease resistance in apple cultivars.docxVIP

摘 要 本研究以苹果（Malus domestica Borkh）主栽品种嘠拉（Gala）和富士（Fuji） 组培苗为试材，研究了叶片离体再生和叶盘法遗传转化的若干影响因素，优化了苹 果叶片离体再生不定芽系统和遗传转化系统，获得了携带 β-1，3-葡聚糖酶基因的 富士转化株系，并对嘎拉和富士转化株系进行了 PCR，PCR-Sourthern 和 RT-PCR 检测，成功获得了有目的基因表达的嘎拉和富士转化株系。进行接种苹果轮纹抗病 检测鉴定时，转化株的 β-1，3-葡聚糖酶、PAL 和 PPO 活性较非转化株高，具有较 强的抗病性。试验结果表明： 1. 富士的不定芽再生培养基中直接加入 10.0～15.0mg/L SNP 可以显著提高其 再生效率。 2. 农杆菌在不加入抗生素的培养基中进行二次悬浮时，部分农杆菌会发生质粒 丢失现象，随悬浮培养时间的延长，丢失率显著增高；质粒丢失程度与目的基因、 启动子和农杆菌菌株的组合有关；同时，在 0.5 h～6.0 h 悬浮时间范围内，质粒丢 失主要与菌液浓度有关，而与悬浮时间关系不大；直接吸取一悬液或离心后分别悬 浮于细菌培养液和植物培养液等不同的悬浮培养方式下质粒稳定性没有差别。 3. 研究了影响农杆菌介导遗传转化的各种因素，优化了遗传转化途径：外植体 在蔗糖浓度为 60～90g/L 的分化培养基上预培养 1~2d；农杆菌二次悬浮后 OD600 值 0.3～0.4 时在摇床上晃动侵染 8min；干燥共培养 2d 后进行脱菌、选择、筛选。 4. 共有 12 个富士转化株系通过了 Kan 抗性检测，具体包括三个方面：①转化 株在附加 Kan50mg/L 的继代培养基上能够连续增殖继代，生长正常。②转化株叶片 在附加或未加 Kan50mg/L 的再生培养基上的再生能力无明显差异。③转化株在附加 Kan50mg/L 的生根培养基中能正常生根。 5. 通过 Kan 抗性筛选的 12 个富士株系经 PCR 检测有 11 个株系呈现阳性，再 经 PCR-Southern blot 检测，证明 17 个嘎拉转化株系和 11 个富士转化株系的检测结 果全部呈现阳性， 证明 β-1，3-葡聚糖酶基因已经整合到嘎拉和富士植株基因组中。 RT-PCR 检测显示，β-1，3-葡聚糖酶基因在 17 个嘎拉转化株系都有不同量的表达， 而只在 3 个富士转化株系中有少量表达。 6. 苹果轮纹病菌在 24～28℃较适宜菌丝体生长，24℃时分生孢子囊和分生孢 子发生最多；培养基 pH5.0 以及接种后在黑光灯下培养有利于分生孢子囊和分生孢 子产生；菌丝体生长到一定程度后，刮除菌丝体对分生孢子囊和分生孢子的发生有 显著促进作用。 7. 对部分嘎拉转化株系接种轮纹病菌，对与抗病性相关的生理指标进行检测， 结果表明：转化株系的 β-1，3-葡聚糖酶活性、PAL 和 PPO 活性均高于非转化株， 表现较强抗病性。 关键词：苹果； β-1，3-葡聚糖酶基因；遗传转化；苹果轮纹病 The Transfermation and Disease Resistant Test of β-1, 3-Glucanase Gene in Apple Major: Pomology Author: Wang Ying Supervisor: Shi Xiao-xin Abstract In this study, the disease-resistant gene β-1,3-glucanase was transferred into apple cultivar Gala and Fuji via Agrobacterium tumefaciens strain EHA 105. The adventitious bud regeneration system and genetic transformation system had been modified by studying the effect of explant types and status on the efficiency of regeneration and transformation. Transgenic plants were obtained and examined by PCR, PCR-Sourthern and RT-PCR. After inoculated Apple Ring Spot,the vigor of β-1,3-Glucanase, PAL and PPO in transformed plants were higher than untransformed plants, which proved that the t