下调cenp-e基因表达对泛素蛋白酶抑制剂lactacystin诱导pc12细胞凋亡影响-effect of down-regulation of cenp - e gene expression on apoptosis of pc12 cell induced by ubiquitin protease inhibitor lactacystin.docxVIP

广州医学院硕士学位论文 下调着丝粒蛋白 E 基因表达对泛素蛋白酶抑制剂 Lactacystin 诱导 PC12 细胞凋亡的影响  PAGE 51  PAGE 52 中英文缩略词对照表 PDParkinson’S disease帕金森病DADopamine多巴胺AchAcetylcholinesterase乙酰胆碱酯酶THTyrosine hydroxylase酪氨酸羟化酶CENP-ECentromere-associated protein E着丝粒蛋白 EDMSOdimethyl sulfoxide二甲基亚砜DMEM FBSDulbecco’s Mimemal essential Medium Fetal bovine serum改良的 Eagle 培养基 胎牛血清HSHorse serum马血清PBSPhosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液UPS Ubiquitin-Proteasome System 泛素蛋白酶体系 MTT Four methyl thiazolyl tetrazolium 四甲基偶氮唑 PAGE Polyacrylamide gelelectrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 HE Hematoxylin-eosin 苏木素-伊红 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 LB Lewy Body 路易小体 ShRNA Short hairpin RNA 短发夹 RNA E.coli Escherichia coli 大肠杆菌 kDa Kilodalton 千道尔顿 PC12 cell adrenochromaffino cell 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 TUNEL Terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法  下调 CENP-E 基因表达对泛素蛋白酶抑制剂 lactacystin 诱导 PC12 细胞凋亡影响 硕士研究生： 杨超豪 导 师： 邵明 教授 中文摘要 第一部分 RNA 干扰技术对 PC12 细胞 CENP-E 基因表达影响观察 1、目的：建立干扰 CENP-E 基因表达的质粒载体，转染 PC12 细胞，观察 CENP- E 的表达。 2、方法：人工合成 PShRNA-CENP-E 质粒 1、2、3，将 3 种质粒，与对照组空载 体质粒以脂质体转染法共同转染 PC12 细胞，在转染 24 小时后用荧光 显微镜评价转染的效率。然后用 Western bloting、免疫组化评价细 胞内 CENP-E 表达变化。 3、结果：成功合成的 3 种 PShRNA-CENP-E 质粒，转染 PC12 细胞的成功率约为 72.5%，Western Bloting 和免疫组化示：质粒 3 转染后，细胞内 CENP-E 的表达水平下降。 4、结论：PShRNA-CENP-E 质粒 3 能特异性降低 PC12 细胞中 CENP-E 表达。 关键词：CENP-E ShRNA 质粒 Western Bloting PC12 细胞  第二部分 NGF 诱导 PC12 细胞神经元样分化及 lactacystin 诱导下建立帕金森 细胞模型 1、 目的：诱导 PC12 长出突触呈神经元样化，观察不同浓度 lactacystin 诱导 PC12 细胞凋亡情况，选择最适合浓度构建 PD 细胞模型。 2、方法：培养 PC12 细胞，传代后，加入终浓度为 50μg/L 的神经生长因子 （NGF）培养 24 小时，按终浓度为 0、5、10、20、30μM 加入 lactacystin，MTT 测细胞活力，HE 染色观察细胞形态。将细胞分 3 组：对照组、双蒸水组、能使细胞活力明显下降的 lactacystin 最小浓 度组，培养 24 小时，进行 α-突触核蛋白免疫组化染色。 3、结果：加入 NGF 细胞 24 小时后，长出突触，呈神经元样分化，MTT 显示活 力结果:10μM，20μM， 30μM 组活力明显较对照组下降（P0.05）， HE 染色示：对照组、0μM ，5 μM 细胞突触较长，胞体完整，10μ M， 20μM, 30μM 细胞密度降低，突触减少或断裂，呈凋亡样改变。 10μM lactacystin 处理细胞出现 α-突触核蛋白阳性细胞。 4、 结论：浓度为 50μg/L 的 NGF 能诱导 PC12 细胞神经元样分化，lactacystin 能诱导其凋亡。浓度为 10μM lactacystin 能明显诱导 PC12 细胞凋亡， 使细胞产生