斜纹夜蛾qm和pdi基因的克隆 表达及其对莱氏野村菌的免疫应答分析-cloning and expression of qm and pdi genes of spodoptera litura and analysis of their immune response to yersinia litura.docx

摘要斜纹夜蛾（SpodopteralituraFabricius）是世界性分布的暴食性农业重大害虫，主要在我国黄河和长江流域严重发生。幼虫取食危害十字花科蔬菜类植物，寄主范围多达99科290种以上。鉴于长期滥用化学农药导致蔬菜农残超标，害虫抗药性增强、生态失衡等诸多问题，微生物农药为主的生物防治受到空前重视。莱氏野村菌（Nomuraearileyi）是田间可以引起斜纹夜蛾流行性病害的有价值的虫生真菌之一。研究斜纹夜蛾对莱氏野村菌入侵的免疫应答分子机理，对于研制更有效的防治斜纹夜蛾的莱氏野村菌真菌剂具有非常重要的意义。本课题基于斜纹夜蛾脂肪体抑制差减杂交文库（suppressionsubtractivehybridization，SSH）筛选到的QM，PDI基因的EST序列着手，分别对两个基因进行克隆并研究其与斜纹夜蛾对莱氏野村菌入侵的应答关系。主要研究结果：（1）关于斜纹夜蛾QM基因的研究结果：①基于斜纹夜蛾QM基因的EST序列，采用SMARTRACERT-PCR技术克隆该基因的cDNA全长，运用ORFfinder，SMART和Expasy等软件推断其氨基酸序列并分析蛋白质物理化学性质以及蛋白结构，利用MegAlign程序对不同物种的QM进行同源性计算，并通过Clustalw和MEGA软件进行多序列分析并构建QM基因的系统发育进化树。结果表明斜纹夜蛾QM基因cDNA全长838bp（并命名为SpLQM），含有660bp的ORF，编码219个氨基酸，预测其蛋白的分子量为25.6KDa，等电点为10.0；蛋白功能位点预测，该蛋白含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点；既没有信号肽也没有跨膜结构域。同源性比较与进化分析发现，斜纹夜蛾QM蛋白与甜菜夜蛾和粘虫的亲缘最近，氨基酸序列相似性分别高达99.1%和97.7%；与单细胞真菌酵母的进化关系最远，但同源性也达到60.8%，说明QM蛋白具有进化的保守性；多序列比对显示QM蛋白家族的含有SH3结合序列和L10核糖体信号肽均很保守，N端比C端保守。基因组结构分析显示，SpLQM基因含有三个内含子。②通过半定量RT-PCT和荧光定量RT-qPCR的技术检测了SpLQM基因在斜纹夜蛾各组织的表达特性，结果表明该基因在所选组织中均有表达，其中在血细胞中表达量最高，是头部的58倍；脂肪体次之，为头部的8倍；在表皮表达量最低。③收集被莱氏野村菌孢子诱导后的斜纹夜蛾血液观察发现，孢子在注入血腔24h还未发芽，注射48h后开始快速繁殖，而注射72h后不仅形成的虫菌体迅速繁殖外，而且血细胞遭破坏变得不完整。同时，采用RT-qPCR技术进行诱导后表达特性研究，结果显示，SpLQM在脂肪体、血组织和中肠中的mRNA表达量均有不同程度的增加：在脂肪体中，注射后的6h~12h开始呈上升趋势，到24h表达量达到最大(为0h的4.6倍），48h开始回落；而在血细胞中，表达量6h开始上升，到12h达到最大(为0h的3.3倍)，24h~48h表达量逐渐降低；在中肠组织中也有上调趋势，只是增加幅度没有在脂肪体和血组织中的大。④分析酶切位点后重新设计引物克隆，以pET30(a)为表达载体，构建pET30a-SpLQM重组表达质粒，并测序验证。将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLYsS感受态细胞中，经IPTG诱导，SDS电泳检测发现该基因以包涵体形式表达，并以切胶回收进行初步纯化，Westernblotting鉴定证实SpLQM基因在大肠杆菌中正确表达并得以初步纯化。（2）关于斜纹夜蛾PDI基因的研究结果：①根据筛选的斜纹夜蛾PDI基因EST序列，采用SMARTRACERT-PCR技术克隆获得该基因的cDNA全长，通过上述的软件进行一系列生物信息学分析。结果显示斜纹夜蛾PDI基因cDNA全长为2367bp(并命名为SpLPDI)，包含一个1485bp的ORF，编码494个氨基酸，预测分子量为55.3KDa；SpLPDI蛋白含有一个17个氨基酸残基的信号肽，两个硫氧还蛋白（-CGHC-）的催化活性域和一个RDEL内质网定位信号肽，且具有典型的PDI蛋白家族的a-b-b’-a’-c结构特点；对序列对比分析发现该蛋白在a和a’结构中的CGHC的催化核心序列和内质网定位信号肽均极为保守；进化树分析表明，SpLPDI蛋白属于第Ⅰ类PDI蛋白簇中，且与家蚕同源性最高为83.0%，与原生动物的隐孢子虫与黑曲霉的亲缘关系较远。②利用半定量RT-PCR对不同组织SpLPDI的进行组织分布分析，并进一步通过荧光定量RT-qPCR对其组织差异性分析。结果表明，SpLPDI在检测的组织中均有表达，但在血液中相对表达量最高，是头部表达量的110倍；脂肪体次之，是头部的41倍；在头部表达量最低。这可能与SpLPDI蛋白在这些