蛙病毒giv-r-sy1301株对鞍带石斑鱼致病性的研究-study on pathogenicity of frog virus giv - r - sy 1301 strain to epinephelus coioides.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注主席委员委员委员委员秘书答辩地点南海水产研究所答辩日期蛙病毒GIV-R-SY1301株对鞍带石斑鱼致病性的研究摘要鞍带石斑鱼（Epinepheluslanceolatus），俗称龙胆石斑鱼，是我国东南沿海重要的名贵水产养殖品种。但是随着养殖规模的扩大，病害发生的频率不断增加。2013年6月，从大规模发病死亡的珍珠龙胆（棕点石斑鱼，Epinephelusfuscoguttatus♀×鞍带石斑鱼,E.lanceolatus♂）体内分离到一株病毒，经鉴定该病毒属于虹彩病毒科蛙病毒属（Ranavirus），并被命名为GIV-R-SY1301。蛙病毒是一类能导致爬行类、两栖类和鱼类等发生严重死亡的、重要的传染性病原体，对许多养殖鞍带石斑鱼危害严重，多次在养殖鞍带石斑鱼体内检测到该病毒的存在。了解蛙病毒对石斑鱼的致病性、临床症状、病理学以及致病和传播机制对于该病的监控、预防和治疗具有重要意义。因此，本文旨在通过人工感染实验来研究鞍带石斑鱼对GIV-R-SY1301的敏感性以及由其导致的临床症状和生理反应，运用HE染色、电子显微镜、免疫组织化学技术、组织原位杂交（FISH）和荧光定量PCR（qPCR）等技术研究其组织病理学和病毒的组织分布规律，为探讨该病毒的致病机制提供基础资料。首先，通过人工感染实验发现蛙病毒对鞍带石斑鱼幼鱼有较高的致病性，注射病毒后的5天内累计死亡率高达80%以上。主要的组织病理学特点是：脾脏和肾脏发生严重坏死，形成大量的核固缩的细胞。脾脏中形成少量的、小型嗜碱性包涵体结构；鳃、肝脏、心脏等组织出现不同程度的损伤、出血并伴随着炎症细胞浸润。免疫组织化学结果显示：脾脏和肾脏组织中免疫信号最为强烈，其次为心脏、胃、鳃和肝组织；肠道和脑中只有微弱的免疫信号存在，而眼睛中没有发现信号。电子显微镜观察发现在病鱼脾脏组织的细胞质中含有大量的病毒颗粒。有趣的是，在存活鱼脾脏和肾脏的脾小体和肾小体结构中，除了形成了大量的异常肥大细胞外，其它一切组织部位没有发现异常。另外，免疫组织化学信号也只存在于这些异常的肥大细胞中。这说明脾小体和肾小体结构对于蛙病毒的感染和复制起重要作用。其次，利用原位杂交和荧光定量PCR技术对蛙病毒GIV-R-SY1301在人工感染发病的鞍带石斑鱼不同组织中的分布进行定位、定量研究。原位杂交结果显示GIV-R-SY1301广泛存在于发病鱼的多个组织中，脾脏和肾脏中杂交信号最强，其次是肠道、胃、鳃、肝，心脏中也有少量的杂交信号，而脑和眼组织中没有杂交信号存在。荧光定量PCR检测结果显示GIV-R-SY1301不同组织中的病毒含量I在4.5×104~6.85×107copies·μg-1DNA之间，其中脾脏、心脏和肾脏中最多。组织原位杂交和荧光定量PCR结果基本一致。最后，我们分别将GIV-R-SY1301病毒液经腹腔注射健康的鞍带石斑鱼，在感染10d中的不同时间采样，来研究其对鞍带石斑鱼血清生化指标变化的影响。结果表明，在注射后1-2d内血清酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和谷丙转氨酶含量呈现显著降低趋势（P0.01）；谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和血糖含量在注射后的4h-2d期间显著下降，4d后又显著上升；总胆红素、总蛋白、白蛋白和球蛋白含量总体上呈现先降低后回升至与对照组相似的水平；尿酸和肌酸激酶含量总体上显著低于对照组。这表明蛙病毒感染对鞍带石斑鱼的肝脏、肾脏、心脏和脾脏等组织的生理和代谢功造成了损伤，以至于造成多个血清生化指标发生了显著变化。关键词：鞍带石斑鱼，蛙病毒，致病性，组织病理学，组织分布，血清生化指标IIStudiesonpathogenicityofranavirusGIV-R-SY1301toEpinepheluslanceolatusABSTRACTEpinepheluslanceolatus,commonlyknownasgiantgrouper,isanimportantaquaculturespecieswithgreatmarketvalue.However,withtheenlargementofthecultivationscale,thefrequencyofthediseaseincreasedmarkedlyandcausedlotsofeconomiclosses.InJuly2013,aranavirusdesignatedasGIV-R-SY1301wasreportedlyisolatedfromthediseasedfarmedgroupers,Epinephelushybrids(blotchyrockcod,Epinephelusfuscoguttatus♀×giantgrouper,E.lanceolatus♂),