无感染增强的广谱抗登革病毒中和抗体的构建及机制分析-construction and mechanism analysis of broad-spectrum anti-dengue virus neutralizing antibody without infection enhancement.docx

无感染增强的广谱抗登革病毒中和抗体的构建及机制研究 无感染增强的广谱抗登革病毒中和抗体的构建及机制研究 第二军医大学博士学位论文 第二军医大学博士学位论文 - - PAGE 11 - - - PAGE 10 - 摘 要 登革病毒是黄病毒属、有包膜的单正链 RNA 病毒，根据其包膜的抗原性不同， 分为四种血清型（DENV1-4），主要以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，广泛流行于 热带和亚热带地区。临床上主要引起登革热（Dengue Fever，DF）、登革出血热（Dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）。其中， DF 是自限性发热性疾病；而 DHF/DSS 则引发血管通透性显著增加，导致血浆渗漏 引发休克，严重威胁患者的生命。世界上约有半数的人口生活在登革热疫区，每年有 超过 5000 万的感染病例，其中有 50 万人发展为严重的登革出血热和登革休克综合征。 但是，临床上缺乏预防和治疗 DENV 感染的有效疫苗和药物，主要以对症支持治疗 为主。基于临床上针对 DENV 感染无有效防治手段的现状，治疗性抗体策略获得了 广泛关注。大量体内、外实验证明：中和抗体能有效阻止 DENV 的感染，不仅能发 挥病毒感染前的预防作用，而且在病毒感染后的一段时期内，依然能发挥治疗病毒感 染的作用。 DENV 基因组编码 3 个结构蛋白(核蛋白 C，膜结合蛋白 M 和包膜蛋白 E)和 7 种 非结构蛋白( NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和 NS5)。其中，包膜 E 蛋白是 病毒的主要结构蛋白，位于成熟病毒颗粒表面，排列成平行二聚体结构，构成病毒颗 粒的主要突起。E 蛋白在空间结构上形成 3 个不同的结构域（ED1，ED2 和 ED3）， 其中，第 3 个结构域（ED3）介导了病毒与靶细胞的吸附，包含最重要的中和表位。 但是，E 蛋白上中和性表位知之甚少，同一血清型登革病毒内不同基因型病毒株 之间的差异对抗体保护作用的影响也还有待于进一步分析。这些问题都阻碍了登革病 毒致病机理的阐明及防治手段的开发。因此，确定登革病毒 E 蛋白的中和性表位， 阐明抗体中和作用的机制，进一步探讨病毒致病性相关的关键氨基酸残基，不仅能促 进对其致病机制的了解，也为登革热的防治提供重要信息；无论从 DENV 发病机理， 还是研发疫苗和治疗药物，都具有重要意义。 在登革病毒致病机制及其抗体治疗策略的研究过程中，人们发现交叉反应性非中 和抗体以及亚中和浓度的抗体能够通过抗体的 Fc 段产生抗体依赖的感染增强作用 （ADE），进而促进疾病的进展，这种现象阻碍了疫苗和单克隆抗体在登革热及其他 相关病毒防治中的应用。登革热常发生几种血清型的交叉感染，因此，抗体要应用于 治疗，必须能同时对四种血清型病毒均能产生有效的保护。现有的强中和活性的单克 隆抗体，多为单个型或只针对少数几个型的单克隆抗体，虽也有多株交叉反应性抗体， 但针对不同血清型病毒的保护效价不一；而几种抗体的混合应用又存在成分复杂以及 需进行多次临床试验的问题 。双可变区抗体技术（ Dual-Variable-Domain Immunoglobulin, DVD-Ig）可以通过将 2 株不同抗体可变区构建于一株抗体分子上并 保持原有抗体的亲和力和保护活性，大大简化了多株抗体混合应用带来的麻烦；获得 的抗体可进一步经过基因工程改造，将抗体的 Fc 断改造以消除 ADE。在针对四种血 清型登革病毒的抗体治疗过程中，通过将只针对几个型的具有强中和活性的单克隆抗 体进行重新构建，可获得同时针对四种血清型登革病毒具有广谱中和活性的双可变区 抗体。 本项研究旨在利用杂交瘤筛选技术筛选获得具有中和活性的单克隆抗体，验证其 体内外中和活性，进一步分析登革病毒 ED3 蛋白的中和表位，明确了抗体结合的关 键位点，初步阐明其中和作用的机制；进一步采用基因工程方法构建嵌合抗体及无 ADE 活性的广谱中和性抗体。研究主要包括四个部分： 一、登革病毒 ED3 区特异单克隆抗体的制备及功能鉴定 我们以重组串联的四种血清型登革病毒 ED3 蛋白作为免疫原，采用常规方法建 立分泌针对登革病毒 ED3 区的杂交瘤细胞系。最终获得了 14 株登革病毒 ED3 区特 异单抗（1B12、1E12、1G6、1H8、2F9、2G9、2H12、3A10、3H12、4H10、5C10、 6E1、6H7 和 7G5）。 为了对这 14 株单抗所针对的病毒进行鉴定，我们以四种血清型病毒感染的 BHK 细胞制备的抗原片对其进行免疫荧光检测。结果证实，这 14 株杂交瘤细胞所分泌的 单抗均特异性针对登革病毒，对其他黄病毒属成员不具有交叉反应；14 株单抗对不