微移植促进h-2半相合小鼠造血恢复的实验研究-experimental study on promoting hematopoietic recovery of h - 2 hemi - compatible mice by micro - transplantation.docxVIP

缩略语英文全称中文全称NSTnonmyeloablativehematopoieticstemcelltransplantation非清髓造血干细胞移植PBMNCperipheralbloodmononuclearcell外周血单个核细胞PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PC5phycoerythrin-Cy5藻红蛋白植物凝血素PHAphytohemagglutininPIpropidiumiodide碘化丙锭Real-timePCRrealtimepolymerasechain实时荧光定量PCRrhG-CSFrecombinanthumangranul-ocytecolonystimulatingfactor重组人粒细胞集落刺激因子rpmrotateperminute每分钟转数TccytotoxicTlymphocyte细胞毒T淋巴细胞ThhelperTlymphocyte辅助性T淋巴细胞摘要研究目的：异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治愈恶性血液病和某些恶性肿瘤、免疫以及遗传性疾病的重要医疗手段。但是，传统的造血干细胞移植一般在大剂量的放疗与免疫抑制剂的预处理后才能进行。然而预处理相关的毒性反应及移植后GVHD、排斥、感染等并发症严重限制了allo-HSCT的疗效。相较于传统的清髓方案，非清髓等减低毒性的方案虽然极大程度的降低了预处理相关并发症的发生，但预处理本身所包含的放化疗、移植后免疫抑制剂的应用，以及患者免疫力低下所致的细菌、真菌及病毒等严重感染仍然夺走了许多人的生命。从既往患者治疗过程中发现，造血干细胞一过性植入，能够起到支持造血的作用，而GVHD的发生与供者造血干细胞在受者体内的植入比例及受者的免疫状态有着密不可分的关系，因此，如何使造血干细胞在受者体内短时间、低比例植入，起到促进受者自身造血恢复，同时避免GVHD的发生成为了我们关注的焦点。于是，本研究所在国际上原创性的提出了“微移植”的新理念，微移植不对受者进行致死性或亚致死性免疫抑制和预处理，也不要形成供体细胞完全或混合植入，而仅通过极微量的免疫抑制预处理、形成微量供者嵌合体。此与传统移植预处理和免疫耐受的理念和观念不同。本课题旨在探讨微移植对化疗后H-2半相合小鼠造血功能的影响，为微移植的临床应用提供动物实验基础和理论依据。研究内容：研究在实施微移植条件下，输注不同数量（1×107?8×107）的H-2半相合供体细胞后小鼠外周血象、供体植入与GVHD情况，并主要探讨微移植对H-2半相合小鼠外周血象，骨髓集落形成情况及脾脏的影响情况。研究方法：1.化疗剂量：6?8周雌性CB6F1小鼠给予大剂量Ara-C腹腔注射，200mg/kg，每日1次，连续2天，第3天改用50mg/kg作为维持剂量继续腹腔注射，每日1次，连续3天。诱导时间为5天。2.供体细胞数量对微移植小鼠血象、植入及GVHD的影响实验根据体重随机将雌性CB6F1分为5组，即Ara-C组（化疗对照组）、Ara-C＋1×107组、Ara-C＋2×107组、Ara-C＋4×107组、Ara-C＋8×107组。每组10只，所有细胞输注组小鼠于末次化疗后2h内尾静脉输入G-PBSC，对照组尾静脉输入等量的生理盐水。比较不同供体细胞输入数量对小鼠外周血象、植入及GVHD情况影响的差异。3.微移植组与G-CSF组对外周血象影响的比较实验根据体重随机将雌性CB6F1分为3组，即Ara-C组（化疗对照组）、Ara-C＋4×107个细胞输注组（微移植组）、Ara-C＋G-CSF组(G-CSF组)，每组10只。对照组尾静脉输入生理盐水，细胞输注组小鼠于末次化疗后2h内尾静脉输入G-PBSC，G-CSF组小鼠给予rhG-CSF10μg/kg皮下注射，每天1次，连续6天。各组小鼠于停化疗第1、3、5、7、9、11、13天采集外周血20μl，EDTA抗凝，利用血细胞分析仪检测小鼠外周血WBC、Hb，PLT数量。4.微移植组与化疗对照组骨髓病理、骨髓细胞集落培养生成单位以及脾脏结构的比较实验：分别于停化疗+5天、+9天各组随机选取3只小鼠进行颈椎脱臼处死，无菌条件下分离出股骨，进行股骨骨髓病理组织形态学改变的观察，并在无菌的条件下留取2×105骨髓细胞进行骨髓细胞集落的培养，观察微移植后小鼠股骨病理组织形态学及形成集落生成单位(CFU)能力的变化。无菌条件下分离小鼠脾脏，行病理组织学检查，观察微移植对小鼠脾脏结构的影响。研究结果：1.化疗后小鼠的血象及骨髓病理变化：化疗后小鼠无呕吐，稀便，停化疗后第1天WBC即明显下降至2.56±0.38，显著低于化疗前10.67±1.6P0.01），停化疗第3天WBC降至最低2.32±0.6