3,4二氨基苯基苯甲酮在基质辅助激光解析离子化质谱分析磷脂中应用.docVIP

3,4二氨基苯基苯甲酮在基质辅助激光解析离子化质谱分析磷脂中应用 　　摘 要 考察了3,4-二氨基苯基苯甲酮（DABP）作为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）新型基质分析磷脂的能力。与传统基质2,4,6-三羟基苯乙酮（THAP）、2,5-二羟基苯甲酸（DHB）、??α??-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）相比，用优化后的DABP基质溶液体系MeOH-H??2O-HCl（80∶20∶3，V/V）分析不同种类的磷脂，可以有效抑制碱金属离子加成现象，得到单一的质子加成峰。样品信号强，所需激光能量低，卵磷脂（PC）的检出限可达到500 fmol。在实际样品鸡蛋和大豆提取物分析过程中，DABP基质对磷脂分子具有良好的分辨率，碎片峰少，谱图背景干净，样品制备方法简单省时。 　　关键词 基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱；基质；3, 4-二氨基苯基苯甲酮；磷脂?? 　　 　　1 引 言?? 　　脂类和磷脂分子，是除蛋白、核酸、多糖外的极其重要的生物大分子????\??。它们不仅构成了生物膜，还是细胞的脂类第二信使分子。脂类组学（Lipidomics）是近年来新提出的组学概念，可以定义为“确定细胞中的全部脂类种类以及所有脂类在脂类代谢、细胞信号转导、转录和翻译过程、基因调控中的生物学作用”????\??。采用高灵敏和高通量的技术手段，主要是质谱技术，检测脂类在生命过程中的系统变化，研究这些变化在信号转导、调控、代谢等各种生命过程中的作用和规律。?? 　　基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）具有分析简便迅速、样品要求低、高灵敏度、高可重复性及抗杂质干扰能力强等优点，广泛应用于蛋白、多肽以及核酸的分析中???┆?，但在脂类分析领域中应用较少。有证据表明，MALDI技术是脂类组学中分析脂类的有用工具，尤其是分析生物组织或细胞提取物的脂类组成????\??。尽管MALDI技术发展日益成熟，但对于实际样品的分析，合适基质的选择仍基于经验的积累。DHB和CHCA在蛋白和多肽的分析上已经被证明是较好的MALDI基质，且DHB也被应用于脂类分析中????\??。此外，文献\以新的化合物为MALDI基质，分析脂类。离子液体型MALDI基质也被应用于脂类分析，与传统固体基质DHB相比，可以提高样品点的均匀性、信号强度及重现性????\??。?? 　　与MALDI分析肽段时相比，分析脂类时碱金属离子加成现象十分严重，影响脂类分子的定性和定量分析。另外，不同结构的脂类分子存在质量重叠，影响结构鉴定????\??。为了解决这些问题，常用薄层色谱（TLC）????\??及高效液相色谱（HPLC）????\??等技术对脂类样品进行预处理。但处理过程繁琐，并会造成样品损失。因此，选择合适的基质成为磷脂直接MALDI分析的关键。3,4-二氨基苯基苯甲酮（DABP）是一种既含有氨基又含有羰基的化合物，它在MALDI-TOF-MS分析中成功用于蛋白、多肽以及核酸的分析????\??。本研究以DABP为基质，用于磷脂的MALDI质谱分析，系统考察了其分析磷脂的能力。结果表明，本方法不仅能降低碱金属离子的加成，而且还能提高离子信号强度，增强样品解吸离子化能力。DABP作为MALDI基质分析磷脂具有可行性和良好的应用前景。 　　2 实验部分?? 　　2.1 仪器与试剂?? 　　Autoflex飞行时间质谱仪（德国Bruker公司）; DABP和THAP（美国Acros Organics公司）; CHCA和DHB（美国Sigma公司）; 卵磷脂（PC）、磷脂酸（PA）和磷脂酰苏氨酸（PS）（美国Sigma公司）; 大豆磷脂软胶囊（山东鸿洋神海洋生物技术有限公司）; 甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司），HCl（优级纯，12 mol/L，天津科密欧化学试剂有限公司），其它试剂均为分析纯。二次去离子水经过Mill-Q水纯化系统处理。鸡蛋购于当地市场。?? 　　2.2 实验方法?? 　　将磷脂标准品（PC, PA和PS）溶在氯仿-甲醇（50∶50，V/V）溶液中，超声1 min， 终浓度为??100 　　??SymbolmA@ mol/L??。蛋黄和卵磷脂胶囊中的脂类采用Folch方法提取????\??。应注意的是磷脂样品溶液要配制在玻璃瓶中，以避免有机溶剂与塑料制品作用产生的分子影响质谱分析????\??。?? 　　DABP配制成20 mmol/L的甲醇-水（80∶20，V/V）溶液，并加入3%（V/V） HCl。THAP, DHB和CHCA配制成20 mmol/L的甲醇溶液。?? 　　样品溶液与基质溶液以1∶1（V/V）混合， 0.5 　　??SymbolmA@ L混合溶液沉积在MALDI质谱的靶上，自