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AdMETHl对培养内皮细胞分泌活性影响 　　[摘要]目的：研究基因重组血管抑制剂Ad－METHl(metalloprotease and thrombospondinl)对培养的内皮细胞分泌活性的影响，探讨血管生成抑制防治增生性瘢痕的可能机制。方法：制备重组血管抑制剂Ad－METHl，转染培养的人脐静脉内皮细胞，通过放射免疫分析法及酶联免疫分析法研究Ad－METHl对内皮细胞分泌内皮素－1(endothelin－1，ET－1)及碱性戍纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factot，bFGF)的影响。结果：基因转染后24h内皮细胞ET－1、bFGF分泌受到明显抑制。结论：Ad－METHl对内皮细胞ET－1、bFGF分泌活性有影响，此是其早期参与抑制增生性瘢痕形成的可能机制之一。 　　[关键词]基因转染；内皮细胞；内皮素－1；碱性成纤维细胞生长因子 　　[中图分类号]R619.6 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0740－03 　　 　　近些年的研究显示，血管生成与瘢痕增生有着密切的关系。我们的研究也显示，基因重组血管抑制剂Ad－METHl可有效抑制兔耳增生性瘢痕的形成。内皮细胞作为主要的修复细胞在瘢痕组织血管生成及增生性瘢痕的形成中发挥着重要的作用，研究Ad－METHl对内皮细胞的生物学影响，对于揭示血管途径抑制增生性瘢痕的可能机制有着重要意义。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　材料：DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibeo)，MTT(Amresco美国)，胎牛血清(华美生物工程公司)，125I－ET放射免疫分析药盒(北京北免东雅生物技术研究所)，碱性成纤维细胞生长因子ELASA试剂盒(武汉博士德生物公司)；酶联免疫检测仪(DGS031，南京华东电子医疗公司)，Y计数仪(Capintce.inc美国)。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　重组血管抑制剂Ad－METHl的制备：利用基因重组技术，将高效血管抑制因子METHl克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack－CMV(strategenge公司)中，用限制性内切酶Pmel(Takara公司)酶切使之线性化，在大肠杆菌BJ5183(strategenge公司)内与腺病毒骨架质粒pAdEasy－1(strategenge公司)同源重组，得到重组腺病毒载体pAdEasy－meth－1，用PacI(Takara公司)酶切线性化pAdEasy－meth－1，乙醇沉淀后，转染293细胞(ATCC公司)，在细胞内包装、重组，制备pAdEasy－methl重组腺病毒质粒。 　　1．2．2　内皮细胞培养：取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，由我校基础部生理学教研室马恒博士惠赠，为HUVEC细胞系)适量接种于DMEM培养基(10％胎牛血清，35.76mg/ml HEPES，青、链霉素各100U/m1)，在5％CO2的37℃孵箱中贴壁生长至70％～80％融合状态，加入0.25％胰蛋白酶消化传代。 　　1．2．3　检测Ad－METHl对内皮细胞分泌ET－1的影响：①取对数生长期的HUVEC，0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/ml，100μl接种于96孔培养板中(实验组、对照组各10孔)，每孔5×103个细胞。将培养板置于含5％CO2、37℃、100％湿度的孵箱中培养，待细胞贴壁、伸展后实验组加入Ad－METHl，对照组加入空载腺病毒各10μl。将培养板在CO2孵箱中分别培养24h后吸取上清100μl待测。②加样：用碘－内皮素(FT)放射免疫分析药盒测实验组与对照组内皮细胞上清液中ET－1的含量。按试剂盒说明中所列程序表加样后充分混匀，室温放置15min，任取两管测量，作为总放射性强度T。3 500rpm(离心力1500g)离心20min，吸取上清液待测。③计数放射性活度：用16探头Y计数仪分别对加样处理后的标准管与样品管的放射性活度进行计数，测量时间1min。标准曲线由美国Capintce.inc提供的软件根据试剂盒中标准品浓度及其相对应的B/B0值自动生成，其中B/B0为纵坐标，标准品浓度为横坐标。数据处理时，根据待测样品B/B0值，在标准曲线上求出待测样品ET－1含量。 　　1．2．4　检测Ad－METHl对内皮细胞分泌bFGF的影响：用碱性成纤维细胞生长因子ELISA试剂盒对培养上清中bFGF的浓度进行测定。实验按照试剂盒说明书所列步骤进行，加入TMB终止液显色后用酶标仪在450nm测定OD值，以TMB空白显色孔为对照。以吸光值为纵坐标，抗原浓度为横坐标，在坐标纸上绘制浓度一吸光值曲线。