Q开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞黑素合成影响.docVIP

Q开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞黑素合成影响 　　[摘要]目的：观察Q开关激光不同能量照射对黄褐斑动物模型黑素细胞的增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影响。方法：用Q开关激光不同能量照射黄褐斑动物模型，取表皮黑素细胞进行细胞培养，采用MTT法测定细胞活力的影响；氢氧化钠裂解法测定黑素的含量；体外多巴氧化反应法测定酪氨酸活性的变化；光学显微镜观察细胞形态学变化。结果：除高能高频组外各能量密度和频率组激光照射后即刻黑素细胞形态无明显变化。第5次治疗后高能量密度照射组明显可见黑素细胞数目减少、体积变小、树突数量减少，长度缩短。而低能量高频率照射组仅黑素细胞体积变小，树突数量减少，长度缩短。与术前比较，低能量低频率照射组黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性无显著差异，但其他三组显著性下降。然而，3周术后黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性增强趋势，有显著性意义（PO.05）。结论：当激光能量和频率达到一定阈值时能抑制黑素细胞的合成和酪氨酸活性，而这种损伤在一定范围内是可逆性的。从而为临床应用Q开关 Nd：YAG 1064nm激光治疗色素性疾病提供了实验依据。 　　[关键词]激光；黑素细胞；黑素生成；酪氨酸酶；动物模型 　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）11-1178-06 　　黑素由位于基底层的黑素细胞合成，黑素合成的类型和数量以及在角质形成细胞周围的分布决定皮肤的颜色[1]，但表皮中过多的黑素会使皮肤颜色变深从而带来美容问题，黑素合成是酪氨酸酶催化的系列氧化还原反应。抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素细胞代谢的物质，一直是皮肤美白及治疗色素增多性疾病的主要策略[2]。虽然Q开关激光在治疗色素增加性皮肤病取得较好疗效[3]，但仍存在色素脱失和治疗后反跳的风险[4]，查阅文献，大量实验研究显示不同能量密度的Q开关激光照射体外培养的人表皮黑素细胞对黑素合成、酪氨酸酶活性有一定的影响。但激光对活体表皮黑素细胞照射的影响和光生物学作用尚不十分清楚，因此，我们通过动物实验初步探讨Q开关激光对体内黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1实验动物： 根据文献[5]制作慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。 　　1.1.2主要试剂和仪器：RPMI1640培养基、标准胎牛血清、 磷酸缓冲盐溶液（PBS）（美国 GibcoBRL 公司）；HMGS 添加剂（美国Cascade Biologics公司）；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶、TritonX-100、NAOH（美国Sigma 公司）；D-Hanks溶液（美国Hyclone公司）；bFGF（珠海东大制药）、转铁蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光纯药株式会社）；ABC试剂盒（博士德）； 倒置显微镜（日本Nikon公司），酶联免疫分析仪（美国Bio-Rad公司）；台式微型离心机；紫外分光光度计（美国Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG 激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司） 　　1.2实验方法 　　1.2.1照射方法：取慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只小鼠背部裸露色斑皮肤（8cm×8cm）划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1min，每周照射一次，共照射5次。实验设每只豚鼠自身激光术前为对照。 　　1.2.2取材方法： 分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1.0cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。 　　1.2.3 细胞培养 　　1.2.3.1标本的分离和细胞悬液的制备[6-7]：取下的豚鼠皮肤组织用0.05%洗必泰浸泡消毒10min；生理盐水漂洗数遍，剪成5mm×2mm的小块；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用镊子将表皮与真皮分离；将表皮组织置于0.25%的胰蛋白酶中室温消化10min；用吸管反复吹打成单细胞；待瓶内液体混浊时加入与胰酶等量的含10%胎牛血清终止消化；100目筛网过滤；吸取细胞悬液于离心管中，1 000r/min离心10min；弃上清，加入RPMI