CCR―2在胶质瘤血管生成中作用机制研究.doc

CCR―2在胶质瘤血管生成中作用机制研究 　　【摘要】 目的：探讨单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）受体CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用。方法：通过免疫组化法检测CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中表达情况，运用MCP-1活化CCR2之后，通过RT-PCR检测N9细胞的血管内皮因子（VEGF）和白细胞介素-8（IL-8）的mRNA表达水平，通过Western blot法检测二者的蛋白表达水平。结果：CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中有较高的阳性表达；经过活化之后可以增强N9细胞的VEGF和IL-8mRNA及蛋白表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义（P0.05）。结论：胶质瘤细胞中CCR2活化可以促进血管内皮因子及白细胞介素-8的表达，进而具有促进血管生成的作用。 　　【关键词】 单核细胞趋化蛋白1； 单核细胞趋化蛋白1受体； 胶质瘤； 血管生成作用 　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.22.035 　　胶质瘤是人体血管化程度最高的肿瘤，其具有高复发率的临床特点，新生的血管不仅为肿瘤的生长提供营养支持，还构成了肿瘤侵袭的途径，单核细胞趋化因子MCP-1是CC趋化因子超家族重要成员，在肿瘤细胞中可高表达MCP-1及其受体CCR-2[1]。研究表明小胶质细胞及巨噬细胞中CCR-2表达升高[2]。本研究提出胶质瘤细胞可能通过MCP-1/CCR-2途径改变胶质瘤血管生成的微环境，参与胶质瘤细胞侵袭，从而更好的解释CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂、细胞与仪器 试剂：胶质瘤细胞系N9细胞（中国科学院细胞库），含血清的完全培养基及不含血清培养基（美国GIBCO公司），PCR试剂盒（上海硕盟生物），免疫组化试剂盒（武汉博士德），HRP标记山羊抗小鼠IgG，HRP标记山羊抗兔IgG（上海碧云天生物），含EDTA的胰酶（美国GIBCO公司），一抗：VEGF、IL-8兔单克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG（美国Santa Cruz公司）。仪器：细胞培养超净台（苏州净化），培养箱（美国Queue systems），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），高转速冷冻离心机（德国BiofugeStratos），-80℃ -4 ℃冰箱（日本松下），高压消毒箱（美国Tuttnauer），转膜仪及电泳仪（美国伯乐公司），PCR仪（澳大利亚Rotor-gene）。 　　1.2 细胞培养与传代 胶质瘤细胞系N9细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，置于5% CO2、37 ℃孵箱中传代培养。当细胞密度达到4×106以上的时候进行传代，清洗培养基后，用含0.02% EDTA的胰蛋白酶进行细胞消化，倒置显微镜观察细胞回缩即终止消化，加入同体积的有血清培养基，吹打，5 min 10 000 r/min离心，弃上清，取细胞悬液，计数后接种到新的培养瓶中。 　　1.3 CCR2活化 待细胞贴壁生长至4×106，对照组细胞用常规培养基，观察组运用MCP-1处理细胞，50 ng/mL MCP-1分别于0、12、24、36、48 h诱导活化，提取培养上清用于检测VEGF、IL-8蛋白分泌情况，细胞用于提取RNA，以分析VEGF、IL-8 mRNA的表达。 　　1.4 免疫组化方法 采用SP检测法，加入3%过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，50 μL非免疫动物血清封闭，加50 μL VEGF、IL-8一抗过夜，50 μL生物素标记第二抗体，辣根过氧化物酶孵育，DBA显色，苏木素复染，中性树胶固封。结果判定：阳性细胞为细胞胞浆胞膜在倒置显微镜下出现深棕黄色的染色。 　　1.5 RT-PCR（半定量逆转录聚合酶链反应）方法 提取总RNA。取2 μg总RNA行逆转录cDNA，取20 μL作为反应体系。PCR反应由逆转录产物2 μ以及18sRNA和VEGF、IL-8的引物共同组成。反应过程按照标准的RT-PCR步骤进行：首先预变性的反应条件为95 ℃、5 mins，接着进行梯度变性反应，共进行30次的循环。接着对所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍摄电泳图像对所得到的电泳结果进行凝胶成像分析系统分析。内参选择18sRNA作为参照，同样完成以上PCR系统的成像，对得到的半定量结果进行对比分析，通过量化的吸光度积分值进行分析（A值）。 　　1.6 Western blotting方法 提取上清蛋白。SDS凝胶电泳，半干法转膜，加VEGF、IL-8一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶1000）37 ℃孵育1 h。ECL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。 　　1.7 统计学处理 所有采集的数据使用SPSS 21.0统计软