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PCR技术在野生动物疫源疫病检测中应用 　　摘要：指出了野生动物疫源疫病检测工作在整个野生动物疫源疫病监测防控体系中占据着非常重要的作用，介绍了在疫源疫病检测中常用的PCR方法，包括普通RT-PCR、免疫PCR和实时荧光定量PCR等，以期为野生动物疫源疫病的检测提供参考。 　　关键词：疫源疫病；PCR；检测，实时荧光定量 　　中图分类号：S853文献标识码：A文章编号2016 　　1引言 　　野生动物疫源疫病监测防控是当前林业工作的一项重要任务，包含了监测、检测、预警和防控等一系列工作，其中检测工作在整个野生动物疫源疫病监测防控体系中发挥着非常重要的作用。野生动物疫源疫病检测分为常规检测和疫情检测，常规检测主要是在野生动物疫源疫病流行高峰期，对救治的野生动物和随机捕捉的野生动物进行粪便、血液和羽毛采样并检测；疫情检测是对死亡的野生动物进行采样检测，分析确定是否发生疫情。 　　野生动物疫病种类繁多，危害性大，在野生动物种群之间传播速度快，且易传染给人类，威胁社会公众卫生安全。如高致病性禽流感是危害野生候鸟最常见的高度接触性、急性传染病，近几年我国出现多次人感染高致病性禽流感的案例，严重威胁社会安全。因此，完善野生动物疫源疫病监测防控体系，建立野生动物疫源疫病检测专业实验室，提高检测水平，对于保护野生动物资源和社会生态安全有着非常重要的作用。PCR技术是一种基于DNA变性与复性原理，高效扩增体外特定DNA片段的技术[1]，这种技术具有快速高效、操作简便、灵敏度高、特异性强、批量检测和痕量检测等特征，目前被应用于生物学基因鉴定、实验和疫源疫病检测等领域。常规PCR是所有由PCR技术衍生出来的检测方法的技术，在野生动物疫源疫病检测中常用的有普通RT-PCR技术、免疫PCR和实时荧光定量PCR技术等。 　　2普通RT-PCR 　　反转录PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，被广泛应用于基因诊断、病原微生物检测等，相比传统病毒分离鉴定试验灵敏度高，特异性强，周期短，可以为病毒的早期诊断提供快速、准确的方法。普通PCR技术已经无法满足多病原体的快速鉴别诊断，因此在常规RT-PCR基础上发展起来双重和多重RT-PCR技术，这种技术能在单个反应体系中同时检测多重病毒[6]，具有高特异性、高效率、低成本等特点，适合大量样本的检测。 周建红[5]等应用普通RT-PCR技术对40分禽类样品进行H5亚型禽流感病毒检测，实验结果表明该方法可基本满足当前的检测需要。张应国[4]等利用多重RT-PCR技术在3～4 h内，完成对36株禽流感及其他病毒分离物检测，结果显示该方法可以快速、特异和敏感的鉴别和监测A型及H9N2、H5N1亚型禽流感病毒。刘婧君[7]分别用单-RT-PCR和双重RT-PCR技术对样品中的禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒进行检测，研究表明尽管该双重RT-PCR方法比单～的RT-PCR检测方法的敏感性下降了10倍，但建立的双重RT-PCR技术仍具有极高的敏感性，特异性和快捷性，具有很高的实用价值。在H3N2亚型禽流感病毒检测研究方面，刘婷婷[9]通过设计筛选2对引物和优化反应条件，建立了一种双重RT-PCR方法，能够有效检测临床样品。 　　3免疫PCR 　　免疫PCR （I mmuno polymerase chain reaction）技术是一种检测微量蛋白的高灵敏度技术，它将抗原抗体反应的特异性和PCR反应的敏感性有机结合起来，能够检出浓度低至2 ng/L的抗原物质，能够有效解决普通RT-PCR方法存在的不足和弊端，在医学和生物技术领域的使用研究取得了很好的效果。目前免疫PCR技术已经开发出不同的种类，包括定量免疫PCR、双相免疫PCR、磁性免疫PCR、免疫捕捉PCR、双抗体夹心免疫PCR等。 　　目前尽管免疫PCR技术灵敏度非常高，正是由于其高敏感性和操作步骤的复杂性，使得免疫PCR技术在操作过程中容易受到交叉污染，影响检测结果，因此如何简化步骤以实现标准化的快速检测就成为免疫PCR 发展的重要探索方向[10]。邓明俊[8]建立了4种免疫PCR检测技术，分别以H5亚型禽流感病毒和H5亚型血凝素蛋白为对象进行检测，研究结果显示它可以对活H5N1和H5亚型血凝素蛋白直接、大批量的检测。 　　4实时荧光定量PCR 　　实时荧光定量PCR技术（real- time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，real-time FQ～PCR）是分子生物学研究的重要工具，具有操作简便、快速