RNA干扰HDACl对人乳腺癌MCF―7细胞生物活性影响.docVIP

RNA干扰HDACl对人乳腺癌MCF―7细胞生物活性影响 　　[摘要]目的：通过RNA干扰乳腺癌MCF-7细胞组蛋白去乙酰化酶1（HDACI）基因，观察对其细胞周期及细胞生长的影响。方法：将乳腺癌MCF-7细胞分成3个组：空白对照组（不予任何处理）、阴性对照组（予以阴性siRNA+脂质体）、siRNA组（HDACl siRNA+脂质体）。人工合成针对HDACl基因的小分子干扰RNA构建HDACI-siRNA重组质粒，通过脂质体转入乳腺癌MCF-7细胞。用Real Time-PCR法和Western-b10t法分别检测HDACl基因的mRNA及蛋白表达情况；MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期变化。结果：转染24h后人乳腺癌MCF-7细胞中HDAClmRNA表达量在siRNA组为（0.15±0.02）、空白对照组为（1.00±0.03）、阴性对照组（0.83±0.04）。与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA组细胞中HDAClmRNA表达量下降明显（P0.05）。Western b1ot显示HDACl蛋白表达量亦明显显示：siRNA组表达量比空白和阴性对照组低（P0.05）。MTT法检测显示3组细胞中，siRNA组的细胞生长速度较其他两组慢（P0.05）。流式细胞术检测显示3组乳腺癌细胞细胞周期分布显示siRNA组细胞周期s期明显减少（P0.05），G1期比例增加（P0.05）。结论：通过RNA干扰能有效的抑制人乳腺癌MCF-7细胞HDAC1的表达，同时抑制细胞增殖、引起细胞周期停滞。 　　[关键词]HDAC1；细胞增殖；细胞周期 　　组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC），是一对功能相互拮抗的蛋白酶，共同负责调控组蛋白的乙酰化与去乙酰化。正常细胞体一旦出现核内组蛋白乙酰化与去乙酰化的失衡，即会导致正常的细胞周期与细胞代谢行为的改变而诱发肿瘤。已有研究表明，由于这对拮抗酶活性的改变，导致组蛋白在转录水平异常修饰，导致异常表达。 　　在组蛋白去乙酰化酶众多亚型中，HDAC1在肿瘤的发生发展的关系中是具有代表性的。同时发现HDAC1的表达水平与患者生存率，肿瘤的大小有关。因此HDAC1可以作为一个独立的乳腺癌临床预后指标。其机制可能因为下调HDAC1后，是HDAC1 mRNA和蛋白表达量减少。 　　本实验旨在通过RNA干扰的手段，下调乳腺癌MCF-7细胞中HDAC1基因的表达，使HDAC1基因表达减少，从而抑制细胞增长、使细胞周期发生改变。 　　1材料与方法 　　1.1细胞及主要试剂 　　乳腺癌MCF-7细胞（上海生物工程公司）。DMDM（美国Gibco公司）；小鼠抗人HDAC1单克隆抗体及羊抗小鼠二抗购自（美国SANTA CRUZ）公司；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；Real Time-PCR检测试剂盒购自（上海吉马技术制药有限公司）公司；胎牛血清购自（维森特生物技术有限公司）公司；双抗购自Gibco公司。 　　1.2主要的设备 　　CO2培养箱（3111，美国Thermo）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、常温离心机（3300，德国Eppend～f公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、SDS蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）、PCR仪（美国Applied Biosystems公司） 　　1.3细胞培养 　　乳腺癌MCF-7细胞培养于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2体积分数的恒温培养箱中培养。 　　1.4 RNA干扰片段的合成 　　siRNA序列委托上海吉玛公司合成，同时合成随机性阴性对照序列。HDAC1siRNA正义链：5一GCUCCUCUGACAAACGAAUTT-3，反义链5-AUUCGUUUGUCAGAGGAGCTT-3。阴性的siRNA正义链5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3反义链-5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。 　　RNA干扰具体转染步骤参照上海吉玛公司转染操作手册。转染6～7h后换成无双抗的DMEM培养液，之后常规培养，转染24小时后做后续处理。 　　1.5 Real Time-PCR法检测乳腺癌HDAC1细胞中HDACl的表达 　　搜集转染后各组HDAC1细胞，采用Trizo法提取总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，检测HDAC1、β-actm的表达。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。β-actm为内参照计算相对表达量（RQ） 　　1.5Western blot法测MCF-7细胞中HDAC1蛋白的表达 　　提取并分离各组总蛋白，将分离后的蛋白转移至硝酸纤维膜上，封闭转移膜，分别加入一抗（兔抗人HDAC1多克