RAPD和SRAP分子标记在真姬菇菌种鉴定中应用.docVIP

RAPD和SRAP分子标记在真姬菇菌种鉴定中应用 　　摘 要：利用RAPD及SRAP分子标记技术对从国内外收集到的12个真姬菇菌株进行遗传多样性分析。结果表明，20条RAPD引物共扩增出多态性条带285条，18对SRAP引物共扩增出多态性条带176条。在相似系数0.800水平时，RAPD和SRAP分子标记分别将12个真姬菇菌株分为5个和6个类群。两种方法均适用于真姬菇种内鉴定，而SRAP标记较RAPD标记稳定性好，更适于真姬菇的种内鉴定。 　　关键词：真姬菇；RAPD；SRAP；聚类分析 　　 　　真姬菇（Hypsizygus marmoreus Sing.）又名玉蕈、蟹味菇等，是一种低温型木腐食用菌，主要分布在日本、北美和欧洲等北温带地区。真姬菇营养价值较高，是一种具有良好保健功能的食用菌，其子实体热水和有机溶剂（甲醇和乙醇等）提取物具有清除体内自由基、降血压、提高免疫力和延缓衰老等功效［1］。该菇在我国上海、山西、河北、河南、山东及福建等省市推广栽培。 　　由于我国真姬菇品种名称使用不规范，造成同种异名、同名异种现象较多，给真姬菇品种交流和产品出口带来不便［2］。因此建立一套准确可靠、稳定性好的真姬菇菌株分类鉴定方法迫在眉睫。 　　本研究运用RAPD (Random Amplified Poly-morphic DNA，随机扩增多态性DNA)标记技术［3］和SRAP (Sequence-Related Amplified Poly-morphism，相关序列扩增多态性)标记技术［4］对收集到的12个真姬菇栽培品种进行亲缘关系研究，为快速准确鉴定真姬菇品种提供依据。其中利用SRAP技术对真姬菇进行种质资源的分析与鉴定在国内外尚属首次。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1供试菌株及来源 　　本研究以收集到的12个真姬菇栽培种为试验材料，菌株编号及其来源见表1。 　　 　　1.2菌丝培养及基因组DNA提取 　　将菌株接种到PDA平板上，25 ℃培养至满皿，收集菌丝。采用CTAB法［5］提取基因组DNA，无菌双蒸水溶解，-20 ℃保存备用。采用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计法检测DNA质量和浓度，根据需要使用无菌双蒸水稀释至25 ng/μL。 　　1.3RAPD试验 　　72个随机引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）对3个真姬菇菌株（1号、8号和11号）进行DNA扩增，选用扩增条带清晰、多态性好的引物，再对12个菌株进行DNA扩增，引物见表2。25 μL的反应体系含2×Master Mix［天根生化科技（北京）有限公司］12.5 μL，模板1.0 μL，随机引物(20 mmol/L）0.5 μL，双蒸水11 μL。扩增程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束扩增。反应结束后，取15 μL反应产物于1.4%的琼脂糖凝胶上电泳，经EB染色后用EC3型凝胶成像系统（美国UVP有限公司）拍照记录。重复3次。 　　 　　1.4SRAP试验 　　选用8个正向引物和8个反向引物（上海生工生物工程技术服务有限公司，见表3）组合成64对引物，对3个真姬菇菌株（1号、8号和11号）进行DNA扩增，筛选出多态性好的引物组合，再对12个菌株进行DNA扩增。25 μL反应体系含2×Master Mix 12.5 μL，模板 1.0 μL，正向引物（20 mmol/L ） 0.5 μL，反向引物（20 mmol/L） 0.5 μL，双蒸水10.5 μL。扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，反应进行5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，反应进行35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃结束扩增。反应结束后，取15 μL反应产物于1.4 %的琼脂糖凝胶上电泳，并经EB染色后使用凝胶成像系统拍照记录。重复3次。 　　 　　1.5数据处理分析 　　将电泳谱带上清晰且具有重复性的条带记为“1”，相对应位置没有条带者则记为“0”，形成原始矩阵。用NTSYS-pc（2.02a）软件计算相似性系数，得到相似性系数矩阵，采用UPGMA法进行聚类分析，生成聚类图。 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2.1基因组DNA的鉴定 　　经电泳分离和分光光度计测定，所得基因组DNA纯度及浓度均较高，如图1所示。说明提取的基因组DNA能够用于进一步试验。 　　 　　2.2RAPD分析结果 　　使用选取的20个随机引物对12个供试菌株进行扩增，共扩增出340个条带。大部分条带分子量在200～