HIV―1型Nef基因重组表达载体构建及其稳定表达细胞系建立.docVIP

HIV―1型Nef基因重组表达载体构建及其稳定表达细胞系建立 　　摘要为了构建艾滋病毒HIV1型Nef基因重组表达载体，利用PCR从pNL43质粒上扩增 HIV1型Nef基因，获得Nef基因完整的编码区，构建可表达Nef蛋白的 pEBmycnef重组表达载体.经鉴定正确后，利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，通过Western Blot技术检测 Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480?胞系，采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后，通过RTPCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平，经长达60 d的传代，最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型. 　　关键词Nef基因；SW480细胞；G418；稳定细胞系 　　艾滋病（AIDS）全称为“获得性免疫缺陷综合征”，是一种由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病.RNA干扰（RNAi）是细胞内序列特异性抑制靶基因表达的机制，具有高效性、特异性和副作用小的特点，将其应用于抗HIV1 治疗研究是近来研究热点[12].RNAi抑制HIV1的复制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干扰HIV1病毒的RNA，据文献报道几乎HIVl的所有基因都可作为干扰的靶点：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi还可以将干扰的位点靶定到细胞上与HIV病毒感染密切相关的受体蛋白、辅助受体蛋白或其他的一些细胞因子[10]. 　　负调控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附属蛋白之一，相对分子质量小，柔韧性大，核心结构呈球形.Nef 不具酶活性，具有衔接蛋白的作用，可下调 CD4，主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ），主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在对抗宿主免疫应答过程中发挥重要作用.Nef 可增强病毒的复制和感染性，抑制 HIV 感染细胞的凋亡，在 HIV 致病机制方面也发挥关键作用.基于Nef在体内的致病机制，多种抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成为潜在的HIV1靶点.本文试图构建稳定表达HIV1型Nef蛋白的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供细胞模型. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　大肠杆菌TOP10感受态细菌、pEBMultineomyc质粒、pNL43质粒、SW480细胞（人结肠癌细胞）均由本实验室保存；RNA提取试剂TRIzol和LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ与NotⅠ购自ThermoFisher公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和去内毒试剂购自广州东盛生物科技有限公司；G418购自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗体、内参蛋白actin抗体和HRP标记羊抗小鼠IgG均购自Santa Cruz公司；细胞培养所用的DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；其他常规试剂与耗材均购自于上海生工生物科技有限公司. 　　1.2引物设计合成 　　参照pNL43质粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0软件设计的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分别在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位点和相应的保护碱基，引物由上海生工生物有限公司合成. 　　1.3HIV1型Nef片段的扩增 　　以pNL43质粒为模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR扩增全长HIV1型Nef基因编码区，全长640 bp.PCR扩增体系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43质粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共进行32个循环，72 ℃继续延伸10 min.得到的PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据