RPMI 1640体外培养结肠小袋纤毛虫正交试验.docVIP

RPMI 1640体外培养结肠小袋纤毛虫正交试验 　　摘要:利用L9(34)正交试验,研究了淀粉量、小牛血清比例和初始pH值3个因素对结肠小袋纤毛虫在RPMI 1640培养基中最高种群密度的影响。方差分析结果表明,初始pH值对最高种群密度影响最大,其次为小牛血清比例,淀粉量影响最小。最佳培养基组成为淀粉40mg/瓶、血清25%(RPMI 1640培养液2.25mL+小牛血清0.75mL);最适宜的RPMI 1640培养液初始pH值为7.0。 　　关键词:结肠小袋纤毛虫;正交试验;RPMI 1640培养基 　　中图分类号:S852.72+4文献标识码:A文章编号:1007-273X(2010)08-0006-02 　　 　　结肠小袋纤毛虫病(Balantidiosis)是由结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)引起的人畜共患寄生虫病,呈世界性分布,主要流行于热带和亚热带地区。目前已知有人及33种动物可以感染该病。人感染后在临床上可表现为腹痛、腹泻、里急后重等症状,有些病例还可表现为泌尿生殖道感染,对人体健康危害较大[1]。猪结肠小袋纤毛虫感染非常普遍,感染率可高达20%～100%[2]。目前,国内外对结肠小袋纤毛虫的研究主要集中在流行病学的调查、临床病例的诊断和治疗等方面,而其致病机理仍然不明,因此,有必要通过其体外培养体系的建立,进行该虫的生物学、致病机制、免疫及药物筛选等研究[3]。RPMI 1640培养基常用于细胞培养,而结肠小袋纤毛虫是单细胞的原生动物,初步试验表明,在RPMI 1640培养基中加入适量淀粉、小牛血清可用于结肠小袋纤毛虫的培养,为进一步优化培养基组成,进行了正交试验。 　　 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1虫种采自洛阳市孟津县某猪场自然发病的病猪粪便,直接镜检发现有大量滋养体。取粪便样少许接种于改进型RSS培养基,在28℃条件下培养48h,镜检后发现大量活动滋养体后用于试验[4]。 　　1.1.2试剂RPMI 1640培养基,10.4g装,Lot 　　No.2535081,GIBCOTM;小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司生产,批号为090324;碳酸氢钠,西安化学试剂厂生产,批号为080423,分析纯;可溶性淀粉,北京海淀区微生物培养基厂生产,批号080417,用前取适量装入洁净小瓶中高压灭菌;青霉素和链霉素(用前用pH值为7.0的0.1MPBS分别稀释成20万IU/mL)。 　　1.2方法 　　 　　1.2.1RPMI 1640培养基配制 RPMI 1640培养基用无菌双蒸馏水溶解,每1 000mL加2.0g NaHCO3。培养基用G6滤器除菌,4℃保存,使用前根据需要用盐酸或氢氧化钠溶液调整pH值。 　　1.2.2正交试验设计根据以往的工作经验,选影响虫体繁殖的淀粉量、小牛血清比例和初始pH值3个因素进行试验,每个因素选3个水平,利用L9(34)正交表,考查上述3个因素对结肠小袋纤毛虫体外繁殖性能的影响。具体试验方案见表1,为保证试验结果的重复性,每个试验组设计两个平行样品,进行有重复观测值正交试验[5]。 　　1.2.3虫体接种及结果观察本试验用安瓿瓶进行培养,每个安瓿瓶内液体总量为3mL,按比例加入相应pH值的RPMI1640培养基和小牛血清,并加入相应量的淀粉。一个试验号设两个平行样品,分别进行标记,作为单位组Ⅰ和单位组Ⅱ进行统计分析。培养基制备完成后,每个安瓿瓶内滴加青霉素和链霉素各1万IU/mL。每个安瓿瓶内加结肠小袋纤毛虫滋养体悬液100μL。检查初始密度后,将安瓿瓶加盖后放入28℃条件下培养,每12h检查一次,直至样品种群密度连续两次下降为止。检查时,将每一个样品混匀后取40μL,滴于载玻片上,盖上盖玻片(18mm×18mm),于100×镜暗视野下检查,计数30个视野下的虫体数。 　　 　　1.2.4数据分析以每一个安瓿瓶内最高种群密度为基本数据,利用有重复观测值正交试验方差分析法进行结果分析,考查不同因素各水平对获得最高密度的影响,同时,利用多重比较(SSR法)确定某一因素3个水平中最佳水平,最后确定培养基最佳组成。 　　 　　2结果 　　 　　2.1试验结果 　　在初始接种量均为8个/30个视野的情况下, 除试验号3、5、7种群密度在接种培养后108h达到最高值外,其余样品均于96h达到密度最高值。L9(34)正交试验结果见表2。 　　 　　2.2方差分析 　　由表2的极差可以看出,3个因素对获得最高种群密度的影响主次顺序为C(初始pH值)、B(小牛血清比例)和A(淀粉量)。对表2的结果进行方差分析,其结果见表3。由于MSe1/MSe21,MSe1与MSe2差异显著,以MSe2进