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siRNA介导FOXA2基因沉默对乙肝病毒复制影响 　　[摘 要] 目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的FOXA2基因沉默对乙肝病毒（HBV）复制的影响。方法：设计靶向FOXA2基因siRNA序列，构建质粒转染HuH-7人肝癌细胞。用QT-PCR和 RT-PCR 检测细胞FOXA2基因mRNA变化；用Western blot检测细胞FOXA2蛋白变化；用Northern blot分析FOXA2基因沉默后HBV RNA表达。结果：构建FOXA2基因稳定沉默的F-S细胞株，FOXA2基因与蛋白沉降效率明显。FOXA2基因沉默后，HBV病毒3.5kbRNA升高，FOXA2抑制HBV病毒的复制。结论：FOXA2基因通过降低3.5kbRNA的表达抑制乙肝病毒的复制。 　　[关键词] siRNA；FOXA2；乙肝病毒 　　中图分类号：R575.1 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）02-052-03 　　DOI：10.11876/mimt201602019 　　乙肝病毒（HBV）引起的传染性疾病。HBV是双链环形结构[1]，3.5kbRNA包含C（核抗原）/P（DNA多聚酶）/S（表面抗原）/X（X蛋白），是HBV进行复制的关键因子。FOXA[2-3]是核转录因子，由FOXA1、FOXA2、FOXA3构成。FOXA是肝转录因子之一，在肝器官的形成和发展及肝进行新陈代谢过程中发挥重要作用。FOXA也是HBV复制的关键调控点，因为HBV病毒所有的启动子和增强子均包含FOXA结合位点。大量实验表明HBV转基因鼠中转入FOXA2，HBV复制降低，进而推断FOXA2可以抑制HBV的复制。因此我们设计靶向FOXA2的siRNA序列，构建质粒转染人肝癌细胞HuH-7，观察FOXA2基因沉默后对乙肝病毒复制的影响。 　　1 材料 　　质粒载体（上海吉凯基因公司）；jetPRIME Transfection Reagent （Polyplus ）；Trizol（Invitrogen）；核酸提取试剂盒（庄盟国际生物基因公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific company）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康为世纪生物公司）；Golden view（庄盟国际生物基因公司）；β-Actin单克隆抗体（Cell Signaling company ）；FOXA2抗体（Abcam company）；miRNA Northern blot reagent （TAKARA company）；ECL显色试剂盒（Thermo Fisher Scientific company ）。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养 　　HuH-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2 条件下孵育箱内培养。EDTA胰酶消化HuH-7细胞，取对数生长期细胞实验。 　　2.2 细胞转染及筛选 　　将1.5×105 HuH-7细胞接种于6孔板中，37℃、5% CO2 孵育箱中过夜。待HuH-7细胞贴壁覆盖率70%～80%时，换新培养液，将含FOXA2-siRNA的质粒与jetPRIME转染试剂按1：2混合滴加到6孔板1、2、3孔细胞上。同时将不含靶序列空质粒与jetPRIME转染试剂按照同样比例滴加到6孔板4、5孔细胞上。第6孔为阴性对照只加培养液（阴性组）。转染3周后挑取单克隆进行鉴定。将FOXA2基因沉默细胞株命名为F-S细胞株；空质粒细胞株命名为K-S细胞株。提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞基因和蛋白，用QT-PCR、RT-PCR及Western blot对siRNA介导FOXA2基因沉默进行验证。 　　2.3 QT-PCR、RT-PCR 法检测FOXA2基因mRNA 　　表达 　　用Trizol试剂1mL分别裂解F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞株；加入0.2mL氯仿，颠倒混匀待两液相分层后离心，取上清液至新EP管中；加与上清液等体积异丙醇混匀，室温放置20min，离心弃上清；加入无水乙醇离心弃上清液并风干；加入30μL RNAase-free ddH2O，反复吹打混匀，获得细胞总RNA，经反转体系得到cDNA。QT-PCR条件：底物液12μL，H2O7.5μL，引物（FOXA2、Actin）2μL，模板2μL。RT-PCR对FOXA2基因引物进行扩增，条件如下：98℃ 10s，60℃30s，72℃30s，32个循环。RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪显示，以ActinPCR扩增作为内参对照。