不同波长选择对酶标比色计检测结果影响.docVIP

不同波长选择对酶标比色计检测结果的影响 　　【摘要】目的：探讨不同波长选择对酶标比色计检测结果的影响。方法：将20份吸光度A450-620nm-B均值为0.523(0.307~0.625)的阳性样本及经过预稀释的临界值样本用HBsAg试剂盒检测，显色完毕后在4种不同波长下比色，连续检测5天，观察20份样本的最大A值、最小A值、吸光度A均值以及临界值样本的最高、最低吸光度A值、阴阳性样本的例数。4种不同波长选择分别为：A450，A450nm-B，A450-620nm，A450-620nm-B。结果：20份样本在4种波长下的A值比较接近，最小A值均0.105。而对于临界值样本，不同波长选择导致了部分检测孔阴阳性结果发生改变。结论：不同波长选择对ELISA检测较高HBsAg浓度的样本时几无影响，而对于临界值样本的影响较大，可至结果误判，应尽可能选择A450~620 nm的比色方式。 　　【关键词】波长；酶标比色；影响 　　文章编号：1009-5519（2008）24-3681-02 中图分类号：R446 文献标识码：A 　　 　　ELISA试验结果的判定无论是定性还是定量分析均应使用酶标比色计进行，较之使用肉眼判断更具有科学性。不同酶标比色计之间的性能存在差异，在波长方面，部分只有单波长（如450 nm）比色，部分为双波长（如450~620 nm）比色。而在结果判定时可有几种选择：(1)以450 nm时的吸光度A值直接计算（A450nm）；(2)以450 nm时的吸光度A值减去空白（B）孔计算（A450 nm-B）；(3)以450 nm的吸光度A减去620 nm吸光度A的差值计算（A450~620nm）；(4)以A450~620nm 减空白B孔计算（A450~620nm-B）。本文以HBsAg检测为例，比较在选择不同波长比色时对检测结果的影响，得到受影响较大的主要是临界浓度样本，报道如下。 　　 　　1 资料和方法 　　 　　1.1 样本：取ELISA一步法试剂盒检测HBsAg阳性样本20份，其吸光度A450-620nm-B均值为0.523(0.307~0.625)。另取HBsAg阳性样本1份，用阴性血清作倍比稀释至临界浓度（本文A值为0.130）备用。 　　1．2 试剂与仪器：试剂盒为北京金豪公司产ELISA一步法试剂，HBsAg质控血清购自江苏省临床检验中心（批号200712，1ng/ml）。Bio Rad 680酶标比色计，YT-WashⅡ型洗板机。 　　1.3 方法：将上述20份HBsAg阳性样本及经过稀释的临界值样本用HBsAg试剂盒检测（临界值样本同时测5孔）。显色完毕后在4种不同波长选择下比色，连续检测5天，观察20份样本的最大A值 、最小A值、吸光度A均值以及临界值样本的最高、最低吸光度A值、阴阳性样本的例数。4种不同比色波长分别为：A450，A450nm-B，A450-620nm，A450-620nm-B。所有样本均按说明书严格操作。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 4种比色方法的A均值及空白孔：见表1。20份样本测定5天在4种波长下的A值比较接近，最小A值均0.105，证实在不同波长比色时对较高浓度的定性分析结果几乎无影响。 　　 　　2.2 临界值样本在4种波长比色的结果：见表2。由于所选择的为临界值样本，不同波长的选择可能会导致部分检测孔阴阳性结果发生改变。 　　 　　 　　3 讨论 　　 　　定性分析的临床意义在于是否检出病原体而与检出量无关。ELISA定性分析中，对于较高浓度的样本，一些外在因素的影响有时尚不足以影响对结果的判断，低浓度样本则不然，无论是非特异性反应如溶血、脂血、标本污染等因素的影响[1，2]，还是不同检测方法之间的差异[3]，甚至同一种检测方法初复检[4]或是加样时差等[5]均有可能造成结果的改变。目前关于波长选择对临界浓度检测样本影响的报道相对较少，但影响是存在的，如邱娜[6]使用单波长比色孔间的CV3%，双波长比色孔间CV3%，原因在于次波长消除了非特异因素的影响。 　　酶标比色计的主波长检测的是特异性反应与非特异性反应的吸光度A值之和，大小通常与样本中反应物的浓度成正比。为了减少非特异性显色对检测结果的影响，在比色时常常选择一个次波长如620 nm，以两者吸光度A的差值来判定检测结果。由于两种不同波长对非特异性反应的吸收峰不一，当A620nmA450nm时常会导致部分样本检测孔、N孔与B孔的A为负数，对于如HBsAg等检测项目，由于N孔的吸光度A值若0.05通常也以0.05计，故B孔的负数虽不会导致高浓度样本结果的改变，但对低浓度样本结果会产生影响。 　　本文所选择的几种比色方法中，使用A450nm进行比色，当N一定时，若不减