一种制备19―去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体方法建立.docVIP

一种制备19―去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法的建立 　　摘要：本文旨在建立一种制备19-去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法。通过丁二酸酐将19-去甲睾酮（19 β NT）半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到偶联物（19 β NT-HAS-BSA），以此进行免疫、筛选，最终获得3株阳性杂交瘤细胞（4D5，6F2，7E7），并制得相应的单克隆抗体。用间接竞争酶联免疫法，对7E7株抗体进行鉴定，发现：抗体的亲和常数为3.35×108 L/mol，半抑制浓度为0.35 ng/mL，表明此抗体对19-去甲睾酮有很强的亲和力；以19-去甲睾酮为参照物，抗体对丙酸诺龙的交叉反应率为80.3%，对甲基睾酮、睾酮、群勃龙、己烯雌酚等的交叉反应率均小于0.2%，表明此抗体具有良好的特异性。由此可知，7E7株抗体可用于对19-去甲睾酮、丙酸诺龙的免疫分析。 　　关键词：19-去甲睾酮 单克隆抗体 间接竞争酶联免疫法 交叉反应率 　　中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00 　　19-去甲睾酮（19-nortestosterone，NT），简称诺龙，分子量为274.4，是一种合成激素，具有雄激素样作用的同化激素，有很强的促蛋白合成能力，参与生长发育的生理调节，促进骨骼和肌肉的生长，被非法用于动物饲料添加剂。本文采用与免疫原不同偶联臂的筛选原筛选抗19-去甲睾酮单克隆杂交瘤细胞株，制备高亲和力抗19-去甲睾酮单克隆抗体，为研制高灵敏度的检测19-去甲睾酮免疫方法提供基础。 　　1材料与方法 　　1.1主要试剂 　　19-去甲睾酮、甲基睾酮、睾酮、丙酸诺龙、群勃龙、己烯雌酚、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇，德国Dr公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、BCA法蛋白质浓度测定试剂盒，生工生物工程；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG1500，sigma；RPMI-1640培养基、HAT选择培养基，Gibco；SP2/0公司保种；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物工程公司；羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP）、过氧化脲、TMB、降脂烷，sigma产品，其它试剂均为分析纯。 　　1.2主要设备 　　SW-CJ-2FD净化工作台，苏州净化设备有限公司；HF151UV CO2培养箱，Heal Force；TS100电子显微镜，Nikon；TDL-40B 上海安亭科学仪器厂；立式压力蒸汽灭菌器，BOXUN；BSA224S-CW电子天平，Sartorius；酶标仪MULTISKAN MK3，Thermo；明澈TM-D24UV纯水系统，Millipore；精密酸度计ORION 3 STAR，Thermo；分光光度计（北京普析）。 　　1.3实验动物 　　6～8周龄Balb/C雌性小鼠，广东省医学实验动物中心。 　　1.4方法 　　1.4.1完全抗原制备 　　（1）免疫原制备。采用丁二酸酐，EDC法合成免疫原，用TLC点板跟踪。 　　（2）筛选原制备。采用戊二酸酐，EDC法合成筛选原，用TLC点板跟踪。 　　1.4.2蛋白含量的测定 　　按照BCA法蛋白质浓度测定试剂盒使用说明书，对蛋白进行蛋白浓度测定。 　　1.4.3动物免疫 　　6～8周龄Balb/C雌性小鼠，取一定量的抗原与等量的弗氏佐剂乳化，25ug/只，分多点皮下注射。第一次用弗氏完全佐剂，以后用不完全佐剂，共免疫5次，融合前三天不加佐剂20ug/只，腹腔注射。 　　1.4.4抗血清效价及抑制率的测定 　　（1）酶标板准备。用碳酸缓冲液（PH9.6）将筛选原稀释成0.1ug/ml，100ul/孔，4度过夜；第二天用3%脱脂奶粉120ul/孔封闭，37度，60分钟孵育，洗板4次。 　　（2）抗血清效价测定。用PBST将血清稀释不同的倍数，每孔加入50ulPBS，加入50ul稀释好的抗血清，37度，30分钟孵育，洗板4次；加入稀释好的酶标二抗100ul/孔；37度，30分钟孵育，洗板4次；加入显色剂100ul/孔，37度15分钟孵育；加入终止液50ul/孔；在酶标仪450nm处读数。 　　（3）血清抑制率测定。每孔加入50ul，用PBS稀释成不同浓度的NT，加入50ul稀释好的抗血清，37度，30分钟孵育，洗板4次；加入稀释好的酶标二抗100ul/孔；37度，30分钟孵育，洗板4次；加入显色剂100ul/孔，37度15分钟孵育；加入终止液50ul/孔；在酶标仪450nm处读数。 　　1.4.5细胞融合 　　融合半个月前复苏SP2/0细胞，用1×8-氮杂鸟嘌呤培养。融合前3天对小鼠进行冲击免疫，融合前1天做饲养细胞用HAT培养。融合时，脱颈致死小鼠，无菌取脾制备脾细胞在PEG-1500作用下与SP