生物高考一轮复习课件：选修1 DNA和蛋白质技术.pptVIP

走进实验室 基础再现 1.多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 实验课题：多聚酶链式反应扩增DNA片段 2.PCR技术 参与的组成 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 （1）细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用 ①解旋酶：打开DNA双链。 ②DNA母链：提供DNA复制的模板。 ③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料。 ④DNA聚合酶：催化合成DNA子链。 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸）。 （2）DNA的合成方向 DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (3）在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 （3）在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 （4）TaqDNA聚合酶的应用，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化；寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找；实验室中微生物的筛选，是人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 （5）PCR反应的条件：稳定的缓冲液环境、DNA模板、分别于两条模板链结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、能严格控制温度变化的温控设备。 （6）PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（９５ ℃）、复性（５５ ℃）和延伸（７２ ℃）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 过程设计 1.按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）。 2.用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）。 3.盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）。 4.将微量离心管放在离心机上（离心）。 5.将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）。 易错归纳 1.PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性的结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够，等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。 2.PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在的靶基因的同源序列也可能造成假阳性的结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。 精题演习 1.下列有关PCR的描述，不正确的是（ ） A.是一种酶促反应 B.引物决定了扩增的特异性 C.扩增产量按y＝（1＋X）n D.扩增对象是氨基酸序列 2.PCR反应需要的条件为缓冲溶液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，为什么？________________________________________。 在PCR反应中，与解旋酶作用相同的