一种基于磁性石墨烯纸基电化学发光夹心免疫分析方法.docVIP

一种基于磁性石墨烯的纸基电化学发光夹心免疫分析方法 　　摘 要 基于电化学发光及磁悬浮免疫分析策略，结合磁性石墨烯独特的物理化学特性以及纸基电极价格低廉、样品用量少的优势，建立了一种新型免疫分析方法。以人免疫球蛋白 G（IgG）为分析物，采用1乙基3（3二甲基氨丙基）碳化二亚胺/N羟基硫代琥珀酰亚胺（EDC/NHS）法将一抗（Ab1，捕获抗体）固定在磁性石墨烯上，通过直接标记法进行二抗（Ab2，信号抗体）的电化学发光试剂标记，采用磁悬浮夹心免疫技术最大程度减少非特异性吸附，通过纸基电化学发光检测技术测定目标物的浓度。考察了捕获抗体及信号抗体的固定（标记）效果，发现采用的磁性石墨烯不仅提高了免疫物质的负载量，还可以促进电子传递，构建的磁悬浮纸基电化学发光夹心免疫分析法的电化学发光响应峰面积在0.32～1000 ng/mL浓度范围内，与 IgG浓度对数值呈良好的线性关系，检出限为6.4 pg/mL。本方法可实现IgG的定量检测，在低成本、快速免疫检测领域有一定的应用前景。 　　1 引 言 　　电化学发光免疫分析（ECLIA）将电化学、光谱学和免疫学紧密结合，具有电化学电位的可控性、发光分析的高灵敏度及免疫反应的特异性，在医疗诊断具有良好的应用前景[1]。磁悬浮免疫分析（MSIA）不仅保持了悬浮分析的所有优点，利用磁性免疫复合物在近似均相的条件下实现快速的免疫反应，还可在外加磁场作用下高效分离免疫复合物与游离蛋白，已应用于临床免疫学检验中[2]。 　　目前已有商品化的ECLIA仪器，如罗氏系列ECLIA系统，可进行多种临床样品的定量检测，检测下限可达pmol/mL，线性范围最大超过7个数量级。但是这些管道式仪器存在样品用量大、反应池需定期清洗、仪器价格和配套诊断试剂价格昂贵等不足之处。可抛式传感器件由于一次性使用的特点，可以避免以上管道式传感器件存在的问题。2007 年首次提出的纸基微流控芯片[3]是当前制作可抛式传感器件的重要方案之一，研究者基于纸芯片进行了ECL检测[4～9]，但要实现在实际检测中的广泛应用，还需解决纸芯片的加工和修饰、纸芯片流体控制、ECLIA 检测灵敏度以及稳定性问题。目前文献报道的疏水材料尚不能解决阻挡低表面张力的样品渗透或者成本过高的问题； 以毛细作用驱动纸芯片流体运输的方式常造成样品在流动过程中挥发，无法满足复杂样品的多步预处理与反应、多组分同时检测等要求。目前报道的纸基电化学发光检测方法在灵敏度、稳定性方面尚达不到商品化高精密仪器的水平。 　　磁性纳米材料由于兼具纳米材料的特性和磁响应性，作为分离/固定生化物质的理想载体，广泛应用于分离/富集、免疫分析等领域[10～18]。可通过物理[19]或化学[18，20，21]方法对不同类型的磁性纳米材料进行表面功能化，进而固定抗体或抗原获得磁性免疫复合物，建立磁高效分离[18～20，22]或可以反复再生[18]的免疫分析方法。 　　本研究选择一种更为简便的方式――纸基电极，即在印刷电极上，紧密覆盖与电极区域大小相等的纸片，由于免疫过程与检测过程的分离，构建的纸基电极无需复杂的几何通道和疏水界面，少量体积的分析物即可通过毛细作用迅速运输至电极表面，结合磁性石墨烯独特的理化性质，以人IgG为模型分析物，最终建立一种简便、灵敏、低成本可抛式纸基电化学发光检测新方法（见图1），为避免管道式分析仪器样品用量大、成本高等问题提供一种新策略。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　纸芯片电化学发光测试仪由本实验室与西安新启特仪器仪表有限公司联合研制，结构见图2：光电倍增管（PMT）接收窗直径10 mm，纸基工作电极位于接收窗中心，两者间距3 mm； 纸基电极的触点和电路的导线采用弹性连接； 电路中取样电阻、分压电阻等关键器件采用温度控制。纸基电极（Paperbased SPE），由直径为6 mm 1#滤纸片（英国Whatman公司）紧压于TE100印刷碳电极（SPE，三电极体系，台湾禅谱公司）电极区域制成。15 mL磁分离架、8孔磁分离架（德国Millipore公司）； PalmSens3便携式恒电位仪（荷兰Plamsensor公司）； Multiskan GO 全波长酶标仪（芬兰Thermo Fisher Scientific公司）； BRUKERAXS 转靶X射线粉末衍射（瑞士BRUKER 公司）； Gemini SEM场发射扫描电子显微镜（德国卡尔蔡司公司）； Zeba脱盐离心柱（美国Thermo Scientific公司）。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 磁性石墨烯固定一抗 称取2.5 mg 磁性石墨烯于5 mL水中，超声分散，再加入5 mL 0.02 mol/L MES缓冲液（pH 5.5）混匀，分别加入90 mg EDC、