亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与先天神经管缺陷相关性研究.docVIP

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与先天神经管缺陷的相关性研究 　　[摘要] 目的 研究亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与红细胞叶酸浓度的关系。 方法 采用PCR法对育龄女性5 128例进行亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性分析，并分别给予早孕者400μg、800μg叶酸口服补充1个月，比较干预前后红细胞叶酸浓度。 结果 纯合CC型早孕受试者口服400 μg叶酸1个月后平均红细胞叶酸浓度与口服800 μg叶酸者相比较，差异无统计学意义（P 0.05）；突变基因型CT型、TT型早孕受试者差异则均具有统计学意义（P 0.05）。结论 对育龄妇女开展MTHFR基因多态性检测有利于指导补充叶酸剂量，值得临床进一步研究。 　　[关键词] 亚甲基四氢叶酸还原酶； 基因多态性；叶酸；神经管缺陷 　　[中图分类号] R722.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）13-0016-03 　　出生缺陷的围生儿中神经管缺陷约占21%，占比最高，中国每年约有8万～10万名神经管缺陷儿出生 [1]。随着近年来分子生物学技术的发展，叶酸代谢障碍被认为与多种出生缺陷疾病有关，如神经管缺陷、唇腭裂、先天性心脏病和唐氏综合征等[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢的关键酶，一旦MTHFR基因发生突变，则导致人体摄入的叶酸无法转换成有效形式，叶酸利用率下降；MTHFR基因677位核苷酸的多态性形成了CC、CT和TT 3种基因型，相对于正常的CC基因型，杂合的CT基因型MTHFR酶活性降低35%，纯合的TT基因型活性降低70%。MTHFR基因突变导致酶活性的改变，引起叶酸利用障碍，增加了发生神经管畸形（NTDs）的风险[3]。预防性补充叶酸防止出生缺陷已经得到了世界范围内的认可。妇产科医师通常按照统一的剂量（400μg）来建议孕期女性服用叶酸，标准剂量的叶酸补充可能无法满足MTHFR基因发生突变的女性胎儿发育需要[4]。因此对孕期女性进行基因检测以指导临床个性化用药是必要的，本研究拟通过本地区育龄女性的MTHFR基因大样本检测，了解该地区育龄女性MTHFR基因的多态性分布情况，并探讨MTHFR基因多态性与服用叶酸前后红细胞叶酸浓度的相关性。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象 　　经我院伦理委员会批准，收集2009年1月～2013年6月期间就诊于我院门诊的育龄女性，入选标准：育龄期汉族女性，同意抽血化验。病例排除标准：中晚期孕妇；合并慢性肝肾疾病、血液系统病、恶性贫血、胃十二指肠切除术后、精神障碍性疾病。入选实验对象5 128例，其中早孕（孕8～14周）育龄女性753例作为早孕组。 　　1.2治疗干预方法 　　所有入选者均抽取空腹静脉血2mL到乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2抗凝管中，置-70℃冰箱中备用提取基因组DNA进行MTHFR基因多态性检测。早孕受试者根据MTHFR基因多态性检测结果分为CC组、CT组、TT组，然后每个组再随机分为两组，分别给予400μg、800μg不同剂量的叶酸口服补充1个月。口服叶酸前及服用1个月以后均晨空腹抽取静脉全血4mL，加入EDTA抗凝试管内检测红细胞叶酸浓度。 　　1.3 观察指标及检测方法 　　所有入选者均采用PCR法进行C677T 位点MTHFR基因多态性检测；早孕者口服叶酸前后检测红细胞叶酸水平。 　　1.3.1 MTHFR基因检测 首先利用常规饱和酚-氯仿抽提法从全血中提取基因组DNA，测定DNA纯度和浓度后-20℃保存备用。MTHFR基因多态性检测采用PCR法：①MTHFR-C677T引物设计 参照文献进行，上游引物5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3’，下游引物5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’，均由上海生物工程技术公司提供；②PCR反应体系 总体积25μL，其中ddH20 18.5μL，10×缓冲液2.5μL，10mM的dNTPs 1μL，12.5pmol/μL的引物各lμL，DNA lμL，所用DNA提取试剂盒由Takara公司生产（Code No.： R004A）；③PCR反应条件 94℃预变性5 min。94℃变性30 s，58℃复性45s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃终末延伸10 min，最后置于4℃保存；④扩增产物的限制性酶切 取PCR扩增产物8止，用8 U TaqI限制性内切酶于37℃酶切6 h，反应终止后，产物经3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，染色后以DL 75 bp DNA片段长度标准物为参考，在紫外灯下判断结果，并拍照分析基因型[5]。 　　1.3.2红细胞叶酸浓度检测 采用化学发光法检测抗凝血中红细胞叶酸浓度，红细胞叶酸检测仪由山东鑫科生物科技股份有限公司