体外冲击波联合血小板衍生生长因子对成骨细胞促增殖影响.docVIP

体外冲击波联合血小板衍生生长因子对成骨细胞促增殖的影响 　　【中图分类号】R687【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2009)31 - 1402 - 02 　　【摘要】目的:探讨冲击波(ESW)联合血小板衍生生长因子(PDGF)对成骨细胞增殖和分泌骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的影响。方法:培养成骨样细胞(MG-63),制备细胞悬液,将细胞悬液分为四组,分别以ESW(A组)、PDGF(B)、ESW与PDGF联合(C)三种方法干预其中三组,另外一组作为对照组(D);给予相应的干预措施后,在37oC 、5%CO2及饱和湿度温箱内培养24、48、72h,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测上清液中BMP-2含量。结果:用MTT检测法检测发现四组中以C组细胞活力最强,D组最弱,尤其48小时最明显。各组与C组比较差异有统计学意义(P0.05)。用ELISA法检测上清中BMP-2含量,发现各组上清中均有BMP-2表达,其中以D组表达最少,C表达组最多,且各组差异有统计学意义。结论:ESW、PDGF可促进成骨细胞增殖,二者联合作用使成骨细胞增殖及分泌作用增强。 　　 【关键词】MG63细胞;PDGF;BMP-2;ESW 　　 　　 有学者研究表明:ESW能使成骨细胞生长因子分泌增加,从而促进成骨细胞增殖。成骨细胞是骨的增殖及细胞外基质形成过程中重要的功能细胞[1]目前对体外冲击波联合血小板衍生生长因子对成骨细胞促增殖的影响报道较少。本实验通过培养成骨样细胞(MG-63)的实验,探讨ESW联合PDGF对成骨细胞增殖作用,为临床治疗骨折延迟愈合或不愈合提供理论依据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1主要试剂和仪器:主要仪器:冲击波发生器;倒置显微镜(olympus 日本);高速离心机(山西医科大学中心实验室);细胞培养箱(HERACell-150型,德国)培养瓶、皿(sigma,美国);多孔培养板(sigma 美国);酶标仪(山西医科大学中心实验室);无菌操作台(山西医科大学中心实验室)。主要试剂:MG63细胞(上海中科院细胞库)、IGF-1(SBG)、DMEM(山西医科大学中心实验室)、胰蛋白酶(山西医科大学中心实验室)、BMP-2 ELISA试剂盒(武汉博士得)。 　　1.2细胞的分离与培养细胞悬液模型制作:体外培养MG63细胞,当细胞长满培养瓶时用胰蛋白酶消化并进行传代,比例约1:3,每两天传代一次,当细胞长满8瓶培养瓶时每瓶细胞用胰蛋白酶消化约一分钟后用DMEM终止。收集各瓶细胞悬液分装到两个15ml离心管中在高速离心机上1000r/min离心5分钟,收集上清液并用细胞计数板调整细胞密度为1×10^6cells/ml,然后分装4个螺旋帽细胞管中,放在预制的冲击波接收架上等待冲击波干预。 　　1.3模型的分组及干预:将制备的细胞悬液模型分为A:ESW组、B:PDGF组、C: ESW联合PDGF组D:对照组,A、C组使用冲击波发生器施加最佳能流密度0.16mj/mm2,即5kv、100频次的冲击波干预,对照组不施加干预,PDGF组加入细胞因子PDGF,调整密度为10ng/ml,抽取各组细胞部分悬液接种到96孔板上,每组设4个复孔,重复三次,剩余的细胞悬液分别接种到24孔板上,每组6孔,置于37摄氏度、5%CO2及饱和湿度条件的孵育箱培养。 　　1.4 MTT法测定细胞活性:分别于培养24小时、48小时72小时后取出96孔板,弃原培养液,每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h后终止培养,小心吸去孔内培养液每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 　　1.5 ELISA法测定BMP-2含量: 分别于24小时和48小时72小时取出24孔板,收集培养上清液,-20℃保存备用。采用酶联免疫试剂盒,按试剂说明进行检测,酶标仪测定各组OD值。 　　1.6 统计分析:实验结果以SPSS13.0数据统计软件包处理,结果用均数±标准差(x±s),采用2×2析因设计,组间两两比较采用LSD法。P0.05表示有统计学意义。 　　 　　2.结果: 　　 　　2.1 ESW、PDGF、ESW联合PDGF对细胞活力的影响见表1。 　　 　　表1 ESW、PDGF、ESW联合PDGF对细胞活力的影响(OD值) 　　 　　结论:不同组别的MTT比较ESW联合PDGF组活力最强,与各组差别有统计学意义。 　　 　　2.2 ESW、PDGF、ESW联合PDGF组BMP-2含量值见表2。 　　表2 ESW 、PDGF、ESW联合PDGF 各组中BMP-2含量值(0D值) 　　结论: