依达拉奉对大鼠脑缺血损伤后海马组织细胞凋亡影响.docVIP

依达拉奉对大鼠脑缺血损伤后海马组织细胞凋亡的影响 　　摘要：目的 探讨依达拉奉对脑缺血损伤后大鼠海马组织细胞凋亡的影响。方法 取健康Sprague-Dawley成年雄性大鼠60只，随机分为假手术对照组，缺血组和依达拉奉组3组，每组20只。对缺血组和依达拉奉组采用 Zea Longa等法改良复制大脑中动脉狭窄（middle cerebral artery occlusion， MCAO）动物模型，通过Tunel法检测神经元凋亡。结果 缺血组与依达拉奉组Tunel阳性细胞数明显增多。与缺血组比较，依达拉奉组Tunel阳性细胞数明显减少。结论 依达拉奉对脑缺血损伤后大鼠的神经保护作用可能是通过减少海马神经元凋亡进而改善脑缺血损伤后大鼠的脑损伤。 　　关键词：依达拉奉；海马神经元；脑缺血损伤 　　研究表明，脑缺血损伤可引起脑组织内神经化学物质的改变，这些神经化学物质的改变可以直接对神经元和胶质细胞产生神经毒性作用，由此可导致一系列损伤[1]。依达拉奉（edaravone）是一种新型自由基清除剂，具有清除自由基和抑制脂质过氧化的作用，其主要靶位是直接清除一氧化氮、羟自由基及抗氧化活性作用。在脑缺血模型中依达拉奉能减轻脑水肿，延缓神经元死亡，改善神经功能障碍[2]。本研究旨在探讨依达拉奉对脑缺血损伤的改善作用及机制。 　　1材料与方法 　　1.1 动物及分组 选用健康Sprague-Dawley成年雄性大鼠，购自河南省实验动物中心，体重250～280g，合格证号：SCXK（豫）2010-0002。清洁动物房饲养，恒温恒湿[温度（24±2）℃，湿度60%左右]，SPF级大鼠饲料喂养，自由进水（消毒蒸馏水），整个实验期间自由饮水、饮食。60只大鼠随机分为假手术组、缺血组，依达拉奉治疗组（简称治疗组），每组20只。 　　1.2 方法 　　1.2.1 各组动物模型制备 缺血组动物模型制备：采用Zea Longa[3]等法改良制备MCAO大鼠模型：大鼠适应饲养1w，术前禁食12h，禁水4h，10%水合氯醛腹腔注射（0.3～0.4ml/100g）麻醉，仰卧位固定，备皮，颈部正中切口，逐层分离皮肤及皮下组织，暴露右颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，双凝电极电灼离断颈外动脉各分支，手术线结扎颈外动脉颈总动脉主干近心端阻断其血流，经颈总动脉近分叉处切口插入线栓，将线栓顺颈内动脉走向轻柔缓慢推进约18mm时（可感到阻力增大），此时线栓已经通过大脑中动脉起始段进入了较细的大脑前动脉，大脑中动脉主干血流已经被阻断，系紧预先准备好的手术线，固定线栓于颈总动脉上防止滑脱与出血，检查无活动性出血后，将钓鱼线末段固定在皮下。逐层关闭各层组织，0.5 g/只青霉素粉局部抗菌，缝合皮肤。术中保持室温25℃左右，用100W 的白炽灯照射大鼠以维持肛温在（37±1）℃，直到大鼠恢复活动。术后在约20℃的空调环境下分笼饲养，自由进食、进水。假手术组动物模型制备：此组20只大鼠不进行右颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉的相关操作，其余操作同缺血组。治疗组动物模型制备：此组动物模型操作同缺血组。 　　1.2.2 神经功能评分 对缺血组和治疗组大鼠麻醉清醒后立即根据Longa[4]法（5级4分法）行神经功能缺损评分，判断模型是否成功。0 分（ 0 级） ：无神经功能缺损症状：如提鼠尾观察前肢屈曲，双前肢对称伸向地面；1分（ Ⅰ级）：轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展，对侧前肢出现腕屈；2 分（ Ⅱ级） ：中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈，手术的对侧前肢出现肘屈曲；3 分（ Ⅲ级） ：重度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒；4 分（ Ⅳ级） ：不能自发行走，无意识或昏迷。分数越高，动物行为障碍越严重。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级为模型成功，符合入选标准者进行下步实验。根据评分随时补充模型大鼠的数量，保证缺血组和治疗组每组20只大鼠。 　　1.2.4 用药 缺血组大鼠和假手术组大鼠腹腔注射0.9 %氯化钠溶液（1ml/ kg·d），治疗组大鼠注射依达拉奉（3mg/ kg·d），用药时间均为为2w [5]。 　　1.2.5形态学实验 待上述实验内容完成后，处死动物，断头开颅，分离海马，石蜡包埋，4um连续切片。一部分切片在40 × 10 倍光镜下计数每张切片5 个随机视野细胞数，取其平均值作为计数结果。另一部分标本行Tunel法]检测，参考试剂盒说明书进行具体操作步骤，二氨基联苯胺（DAB）显色，中性树脂封片。光镜下每组各选阳性细胞最集中的5个高倍视野，计算出每个高倍视野的阳性细胞数，取其平均值[6]。保留记录各组实验结果，备统计学分析对比。 　　1.2.6统计学方法 首先进行数据的正态性检验和方差齐性检验，应用SPSS13. 0 软件包进行统计学处理，多组间比较