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全人源单克隆抗体体外亲和力成熟策略 　　摘要：单克隆抗体已广泛地应用于临床治疗。人源化的单克隆抗体是目前已上市的治疗性抗体的主要形式。不管是来源于杂交瘤细胞还是噬菌体展示库的抗体， 其亲和力在治疗应用上可能都需要改善。抗体体外亲和力成熟是解决这一问题的重要途径。作者将就全人源单克隆抗体亲和力成熟的策略方面进行综述。 　　关键词：单克隆抗体；抗体体外亲和力成熟单克隆抗体自问世以来，由于其独有的特征已迅速应用于医学很多领域。其中人源化的单克隆抗体是目前已上市的治疗性抗体的主要形式。目前获得全人源单克隆抗体的方法主要是抗体库技术和转基因技术。但是以上方法获得的抗体治疗效果一般很难达到最佳水平，因此需要在体外进行亲和力成熟以期达到临床应用的要求。 　　抗体的体外亲和力成熟是基于体内的亲和力成熟突变和选择的原则。体外亲和力成熟主要包括以下两方面：对低亲和力抗体可变区基因进行突变的引入；有效的筛选方法。本文综述了基于分子水平的全人源单克隆抗体体外抗体亲和力成熟的研究进展、该领域的研究现状以及今后可能的发展方向。 　　1突变的引入 　　进行体外亲和力成熟的首要任务就是获得大量突变体。因此，突变引入策略的选择在体外亲和力成熟中十分关键。 　　1.1致突变细胞株使用大肠杆菌突变细胞在目的DNA序列上随机引入突变的方法来进行抗体亲和力成熟已经被成功使用过了。大肠杆菌突变细胞比正常细胞造成的单碱基替换要高105倍，因为该细胞在DNA复制时期缺失校正性外切酶的活性。但是运用这个方法一般需要反复选择再放大，需要至少4~10轮连续的细菌培养和筛选过程，其周期和工作量非常大。 　　1.2易错PCR易错PCR(error-prone PCR)经常被用来随机突变产生突变体。这项技术基于分子生物学建立的标准PCR技术上进行修改来改变和提高聚合酶错误率。易错PCR的不同在于通过改变反应缓冲液的组成来改变Taq DNA 聚合酶。文献报道此方法的突变率突变的频率在0.11%~2%[1]。不过该方法带有一定的盲目性，在实际工作中成功率不高。近年来该技术的不断改进，应用该方法进行抗体亲和力成熟的案例时有报道[2]。 　　1.3 DNA 重组DNA重组(DNA shuffling)是一种定向分子进化过程，利用重组技术大大加速了可以进化的基因速度。在过去的几年中，DNA重组技术已经显著改善了。因为DNA重组是在不同DNA物种和不同的突变之间的重组，所以可以快速增加抗体库容量。该方法目前被广泛应用于进行抗体的亲和力成熟。Fermer等[3]利用该技术经过两轮DNA重组就把抗体亲和力提高了近1000倍。 　　1.4链重组引入突变的另外一种常规方法是链重组(chain shuffling)。它是将VH和 VL两条链中的一条链固定，结合库中的另外一条链产生次级库来寻找最优越的配对方式。此方法操作稍繁琐，而且轻链和重链文库要求有一定的库容和良好的多样性。通过该方法进行抗体亲亲和力成熟的成功报道很多。例如J.Lou所在研究组利用此方法对BoNT antibodies进行轻链替换，获得的抗体亲和力较原抗体提高了77倍[4]。 　　1.5热点突变在抗体进化过程中，基因突变并不是随进在可变区内发生突变的，而是倾向性的在CDR区的某些位置，这些部位就称为突变热点。这些突变热点往往是与抗原接触的残基，如果将CDR区中与抗原接触的残基中低亲和力或排斥性的残基替换为结合方式更合适的残基，均可以提高亲和力。这种方法突变的位置更为限定，对抗体库容量要求小，有效性高。Steidl S等通过该方法，将一株抗体亲和力提高了5000倍[5]。 　　1.6计算机辅助定向突变计算机辅助药物设计是以计算机化学为基础，通过计算机的模拟、计算和预算药物与受体生物大分子之间的关系，设计和优化先导化合物的方法。随着该技术不断发展，在抗体亲和力体外亲和力成熟方面有了广泛的应用。Lippow SM在已经获得晶体结构的基础上，通过计算机辅助设计进行抗体亲和力成熟获得的抗体比野生型的抗体提高了140倍[6]。计算机辅助设计进行抗体体外亲和力成熟比其它方法具有明显的优势，可以将突变位点控制在一定的范围内，甚至可以有目的地改变某几个或某一个氨基酸位点，使亲和力成熟的效率和成功率大大提高。 　　1.7组合应用以上突变方法各有优缺点，如致突变菌株、易错PCR、DNA重组和链重组引入突变都是随机性的。前两种在小范围内引入突变，后两种能够在较大范围内引入突变。热点突变和计算机辅助技术可以进行定点突变。其中热点突变得到的突变库太少，实用性不高。计算机辅助突变的方法能够将突变定位于一些潜在可以提高突变的位点，针对性比以上几种方法更强。一般来说，单凭一种亲和力成熟的方法难以获得亲和力较大提高的抗体突变体。所以需要采取组合突变的