医学细胞生物学 第四篇.ppt

第四章 细胞生物学的研究技术 第一节 细胞形态结构的观察 显微结构（microscopic structure）----通过光学显微镜观察到的细胞结构。 （一）普通光学显微镜 （二）相差显微镜 （三）微分干涉差显微镜 （四）暗视野显微镜 （五）激光扫描共聚焦显微镜 （六）荧光显微镜 荷兰物理学家 F. Zernike 于1932年发明：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光程差转变成振幅差，从而提高了活细胞结构的反差，解决了对活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。 Nomarski于1952年在相差显微镜原理的基础上发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。 视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品； 光源为短波光，分辨力高于普通显微镜； 用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描，得到光学切片，并可整合为三维影像。 超薄切片技术 负染色技术 （染背景不染样品） 冰冻蚀刻复型技术 扫描电镜样品制备技术 冰冻蚀刻复型技术 标本置于-196?C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。 有效获得单一类型的细胞 获得较大的细胞群体 细胞工程方面的应用 一、细胞器和大分子的离心分离 适合于各种细胞器和大分子的分离。 原理：利用各种细胞器或组分的大小和相对密度的差异，在同一离心场内的沉降速度不同。 过程：匀浆，离心分离，分析 二、细胞的体外培养 一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，而且可以表现出它在体内的一些分化特性。 1. 细胞体外生长条件： 培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、 糖、盐 支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质 其它条件：pH值、CO2、温度、湿度，无菌环境等 原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养 传代培养：对已有的细胞进行的继续培养 细胞系：通过原代培养所长出的细胞培养物 有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代 连续性细胞系：能够连续地传很多代 永久性细胞系：能够无限地传代 细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。 一些有关细胞培养的概念 2. 体外培养细胞的特性 形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形… 增殖特性：一般细胞能传十代左右， 少数细胞可传40-50代 极少数细胞变成永久细胞 人为分为 I II III 三个时期 （增殖期、平殖期、衰退期） 功能特性：可以保留活体组织中的某些功能特性，随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。 三、细胞融合 细胞融合（cell fusion）：两个或两个以上的细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。 人工诱导的方法：生物诱导法、化学诱导法、物理诱导法。 异核体（heterokaryon）：两个不同的细胞融合到一起，但其核仍然是分开的。 合核体（synkaryon） 杂种细胞系（hybrid cell line） 第三节 细胞组分的分析 马达 冷冻 真空 沉降物 转子 装甲室 匀浆物 肝脏 上清夜 完整 细胞 完整 细胞 1000g 20min 核 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 微粒体 内质网 100000g 120min 105000g 20min DNase 静置20min 10000g 20min 核糖体 二、蛋白质的层析分离 蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性质和功能活动复杂。 原理：利用分子的大小、极性及亲水性等生化特性将不同类型蛋白质进行分离。 分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲和性）；高压液相层析。 凝胶过滤柱层析 离子交换柱层析 亲合层析 * Techniques in Cell Biology Preparatory observe put forward theoretics Design control tests Collect data Explain results Devise conclusion Refer to knowledge 普通光镜 特殊光镜 形态观察 扫描电镜 高压电镜 透射电镜 扫描隧道显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 光学显微镜 电子显微镜 扫描探针显微镜 原子力显微镜 一、显微结构的观察 普通光学显微镜 目镜 物镜 集光器 载物台 光源 最大分辨率 0.2μm；最大放大倍数 1000倍。 H-E染色后的上皮柱状细胞 相差显微镜 (phase c