北五味子总木脂素对脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡及p―AKT表达影响.docVIP

北五味子总木脂素对脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡及p―AKT表达影响 　　[摘要] 目的：观察北五味子总木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）对局灶性脑缺血损伤大鼠神经细胞凋亡和PI3K/AKT信号传导途径的影响，并探讨其作用机制。方法：用北五味子总木脂素高、中、低剂量组（100，50，25 mg?kg-1）给大鼠分别灌胃给药，连续14 d后，线栓法建立脑缺血损伤模型，进行神经功能评分，TTC染色观察大鼠的脑梗死面积，HE染色观察脑组织的病理形态学改变，免疫组化检测脑组织中Bcl-2和Bax的表达，Western blotting检测脑组织内p-AKT和AKT蛋白的表达情况。结果：与模型组比较，北五味子总木脂素高、中、低剂量组均能不同程度缩小脑梗死面积；改善脑组织的病理形态学改变；促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达，同时促进p-AKT的表达。结论：北五味子总木脂素对大鼠脑缺血性损伤具有一定的保护作用，机制可能与其促进p-AKT活性增加，提高脑组织抗缺血损伤的能力和抑制神经细胞的凋亡有关。 　　[关键词]五味子；脑缺血；磷脂酰肌醇3激酶；凋亡 　　缺血性脑血管疾病是临床上的常见病和多发病，严重威胁着人类的健康。脑缺血后机体产生大量的自由基，毒性氨基酸等使凋亡相关基因激活，启动凋亡信号通路，促进神经细胞出现凋亡和坏死。研究表明，PI3K （phosphatidylinositol 3-kinase，磷脂酰肌醇3激酶） /AKT（serine-threonine kinase，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）信号通路参与了凋亡过程并且与脑缺血损伤密切相关[1-2]。五味子Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.是我国传统中药材，具有敛肺，滋肾，生津，收汗，涩精等作用。具有抗氧自由基，增强机体免疫力，抗肿瘤等药理作用。此外五味子还具有改善心肌，促进微循环，减轻脑水肿等功能[3-6]。五味子的主要活性成分是木脂素，关于北五味子总木脂素（S.chinensis lignans，SCL）对脑缺血损伤的保护作用及机制目前尚不明确。本研究通过建立局灶性脑缺血损伤大鼠模型，观察北五味子总木脂素对大鼠脑缺血性损伤的保护作用及对PI3K/AKT信号通路的影响，探讨北五味子总木脂素保护脑缺血的机制。 　　1材料 　　1.1药品与试剂 SCL由北华大学林学院食品科学与工程实验室提供；红四氮唑（TTC，上海市先进农场试剂厂）；免疫组化试剂盒（南京建成生物技术有限公司）；Bcl-2，Bax，p-AKT和AKT抗体（Sigma公司）；MCAO栓线（北京沙东生物技术有限公司）。 　　1.2动物 健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，合格证号0022216，清洁级动物室饲养，饮水不限，定时喂食。 　　1.3仪器 GIS-2008天能凝胶成像分析仪（上海天能科技有限公司）；立式电泳仪（江苏海门市麒麟医用仪器厂）；病理图像分析系统（美国 Media Cybernetics公司）。 　　2方法 　　2.1北五味子总木脂素的制备过程 北五味子木脂素由北华大学林学院食品科学与工程实验室优选北五味子新品种，采用超临界CO2流体萃取，模仿口服药物在胃肠道的转运过程，选用特定pH依次连续提取（半仿生法提取）；经分子蒸馏，其蒸馏温度110 ℃，进料速率65 L?h-1，真空度0.7 Pa；再通过AB-8大孔树脂处理，总木脂素流量1.52 g?L-1，洗脱速度1 mL?min-1，乙醇95%、洗脱率78.9%；采用硅胶柱色谱法，200～300目硅胶，以石油醚-乙酸乙酯60∶1洗脱，得木脂素组分，采用紫外分光光度法，在570 nm检测总木脂素，其纯度为93.5%。 　　2.2模型制备 雄性健康SD大鼠，末次给予药物2 h后用10%水合氯醛进行左下方腹腔注射麻醉，10 min进入麻醉维持期，将其仰卧位于鼠台上固定，颈部正中线纵向切口，先分离右侧颈总动脉（CCA），后分离颈外动脉（ECA）和其下方的颈内动脉（ICA）。在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹于CCA近心端夹住，用手术线于远心端打一活结，用圆头带有标记点的MCAO栓线通过事先用眼科剪在CCA上剪的切口进入向ICA缓缓推入约18 mm（从ICA和ECA分叉处算起），感到有轻微阻力且标记点在动脉分叉处左右停止，此时说明栓线已到达大脑前动脉。用手术线结扎固定栓线，缝合皮肤。假手术组只分离出颈外动脉以及颈内动脉，其他步骤同上但不进行栓塞。待大鼠清醒后，观察大鼠的体征，对大鼠进行神经症状评分[7]，行为学评分≥2分的大鼠，表明模型的制作成功。24 h后立即断头取血取脑，同时进行病理组织