北京地区核桃黑斑病病原菌分离致病性测定和16SrDNA序列分析.docVIP

北京地区核桃黑斑病病原菌分离致病性测定和16SrDNA序列分析 　　摘要：核桃黑斑病是危害核桃生产的重要细菌病害，造成树势衰弱，减产严重，甚至树体死亡。2008年在北京郊区栽植的幼树上发现疑似病害，且呈爆发之势。为确定其病原菌分类地位，用组织分离法分离核桃黑斑病菌，纯化培养后用针刺接种法回接到健康核桃树枝条和叶片上，14 d后叶片和枝条分别出现典型病斑，接种发病组织再分离所得病菌性状、16SrDNA与初分离的一致，完成柯赫氏法则验证；以分离的核桃黑斑病菌总DNA为模板，采用细菌16SrDNA的通用引物，通过PCR扩增到约1.5kb的片段，克隆到pMD-18T载体。测序结果表明克隆的16SrDNA片段长为1453个核苷酸，通过GenBank上BLAST分析，表明该病原细菌为Xanthomonas campestris。 　　关键词：核桃黑腐病；细菌；致病变种 　　中图分类号：S664.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)03-469-05 　　 　　核桃黑斑病，又名核桃黑腐病，在欧美一些国家有发生。在我国，该病广泛分布于河北、山东、山西、辽宁、河南、江苏、浙江、四川、云南、山西、甘肃等省核桃产区。据对河南安阳等地调查，一般植株受害率70％～90％。果实受害率lO％～40％，严重时达65％以上。甘肃省主要分布在兰州、天水、临夏等地，病果率80％以上。核桃黑斑病主要危害叶片、嫩枝、幼果及花器，在叶片上出现圆形及多角形小褐斑，严重时相连成片，病斑外围有水渍状晕圈：枝梢上病斑长形，黑褐色，稍凹陷，严重时因病斑扩展包同枝条而使上段枯死；花序受侵后，产生黑褐色水渍状病斑；幼果受害时，果面发生黑色小斑点，无明显边缘，逐渐扩大成片变黑，并深入果肉，使整个果实连同核仁全部变黑腐烂脱落。此外，核桃黑斑病除危害核桃外，还能侵染许多核桃属植物。 　　关于核桃黑斑病病原菌的分类，目前普遍认可的是Xanthomonas arboricola pv.juglandis，该病原菌在休眠芽上越冬，春季侵染芽，靠昆虫、花粉和雨水传播。土壤条件和栽培管理是该病害发生的主要因素。混有代森锰、代森锰锌或代森锌的铜制剂作为杀菌剂。在芽大量形成而叶片刚展开时进行第1次喷药，对该病害具有最好的防效。Sohani等用16个不同基因型的核桃与该病原物进行抗病性对比试验，找出了最抗病的基因型94和最感病的基因型69。 　　由于细菌16S rRNA基因具有高度的保守性且长度适中(约1500个核苷酸)，便于测序，细菌分类学家广泛采用16S rDNA序列分析法来进行遗传特性、分子差异、发育进化和分类学研究。通常将未知细菌的16S rDNA序列与GenBank中已提交的16S rDNA序列进行同源性比较，便可初步确定该细菌的种属地位，某些细菌甚至可以鉴定到种的水平。当前普遍的观点认为：16S rDNA序列同源性小于98％，则可认为属于不同的种；同源性小于93％-95％。则可认为属于不同属。 　　2008年在北京市郊区县进行果树病害调查，发现核桃幼树上发生核桃黑斑病疑似病害，在幼嫩枝条、叶片、幼果以及主干上均发现病斑，病株率高达40％，且呈爆发之势。为鉴定该病的病原菌，以便进行有效防治和控制蔓延，我们对其病原菌进行了分离、致病性测定和16S rDNA序列分析，初步确定了病原菌分类地位。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　采集表现典型黑斑病症状的当年生幼嫩枝条。分别放在自封袋中带回实验室，直接分离病原菌或冰箱冷藏保存。 　　3a生健康核桃树，用于回接试验，进行致病性测定。 　　 　　1.2　试剂 　　Taq DNA聚合酶、dNTPs、10xTaq buffer、氨苄青霉素、DNA Marker、PCR产物回收试剂盒购于北京奥赛博生物技术公司；DNA提取试剂盒购自中科瑞泰生物技术公司；PCR克隆载体为pMD-18T，购自大连宝生物公司。 　　 　　1.3　菌株的分离、保存与致病性测定 　　用组织分离法分离病原菌。取表现典型症状的幼嫩枝条表面消毒后去掉表皮，将病斑部位的木质部组织在灭菌研钵中捣碎，加入灭菌水混匀，在LB平板上划线分离。28℃下培养。参照核桃黑斑病菌菌落生长形态及颜色，进行分离纯化，所得菌株保存在LB平板和试管斜面培养基上，4℃冰箱保存。 　　致病性测定采用针刺法接种。将保存的菌种划线接种于LB平板上，28℃活化培养，然后挑取单菌落在液体LB培养基中扩大培养，配制108cfu?mL-1菌体悬浮液，分别接种健康核桃枝条和叶片。从植株顶芽下的第3张完全展开叶片的叶腋处用一次性无菌注射针刺到幼嫩枝条上。抽出注射针后滴上1滴浓度为108cfu?mL-1的细菌悬浮液，用脱脂棉包住伤口，以灭菌水为对照，每处理