区分高低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT―PCR方法建立.docVIP

区分高低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT―PCR方法建立 　　摘要：为了在临床上快速、有效区分高低致病性PRRSV，参考GenBank发表的代表性毒株，根据高致病性毒株Nsp2基因上有30个氨基酸不连续缺失的特点，设计并合成1对引物，扩增高低致病性PRRSV Nsp2基因的目的条带长度分别为644、734 bp，从而将二者区分开来。用本方法对长春及其周边地区送检60份病料进行盲检，检出10份高致病性PRRSV。并与N蛋白基因引物RT-PCR诊断方法进行比较，结果均一致，表明该方法准确性高。本研究所建立的RT-PCR方法为PRRSV在临床上的快速诊断和实验室流行病学调查提供了简捷的技术手段。 　　关键词：PRRSV；Nsp2基因；RT-PCR诊断；流行病学调查 　　中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0226-02 　　2006年以来，中国南方部分地区猪场暴发高热为特征的传染性疾病，并逐渐蔓延扩散到北方各地区，给养猪业带来了巨大的经济损失。这种传染性疾病后来被命名为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），该病具有传播速度快、发病率高、病死率高的特征，并且继发感染链球菌等，与伪狂犬等病毒混合感染增加了临床诊断的难度。因此，建立一种能够快速，有效、准确的检测方法在 PRRS 的防控上具有重要意义。经病原分离及分子流行病学分析，国内流行的高致病性毒株主要是由1种带有Nsp2基因部分缺失以及多个位点发生突变对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。 　　PRRSV基因组毒株间具有较高的遗传变异性，M蛋白在各毒株间比较保守，同型毒株间M蛋白序列同源性大于96%，欧洲、美洲型毒株间序列同源性在78%～81%之间[1]；其次N蛋白保守性较高，欧洲、美洲型毒株间的同源性在59%～63%之间，同基因型毒株之间的同源性可达 96%～100%[2]。GP5、GP3、NSP2是容易发生变异的3个蛋白，其中GP5变异程度最大，欧洲、美洲型毒株间GP5同源性仅为52%～55%[3]其次为GP3，同一毒株间同源性为 86%～98%，2个基因型毒株间GP3氨基酸同源性为54%～ 60%，GP3多数变异发生在N末端，2个基因型GP3 N末端35个氨基酸残基的一致性不到30%[4]。 　　在PRRSV基因组中非结构蛋白NSP2变异程度最显著，美洲型同型毒株间同源性约为80%，美洲型、欧洲型毒株间同源性仅为 40% 左右，NSP2 的中心区易变异，并且变异不仅表现为个别碱基的置换，还表现在缺失和插入上。 Gao等对PRRSV分离株HB-2 （sh）/2002的全基因序列测定分析表明，NSP2蛋白存在编码12个氨基酸的连续36个核苷酸的缺失，这是国内首次发现的NSP2蛋白存在缺失变异现象[5]。 　　本研究根据 Nsp2基因序列设计引物，该引物包含 Nsp2基因缺失序列，分别对高致病和经典毒株的基因片段进行特异性扩增，通过 RT-PCR 扩增目的基因片段长度的不同可将二者区分开来。试验结果表明，新建立的RT- PCR 鉴别方法可以达到快速、简捷、有效区分高致病性变异 PRRSV与经典型PRRSV的目的。 　　1 材料与方法 　　参考GenBank上多株PRRSV毒株序列，利用Primer Premier 5.0设计并合成1对引物，所设计这对引物覆盖Nsp2基因整个缺失区域。由于高致病性PRRSV变异株与低致病株相比发生90个核苷酸的缺失，所以高致病性株和经典株的预期扩增产物长度分别约644、734 bp。 　　上游引物：5′-CGAGCTTAAAGACCAGATGGAGGAG- 3′；下游引物：5′-CTTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT- 3′。 　　按照Simply P 总RNA提取试剂盒说明书，分别对PRRSV CC-13分离株RNA基因组进行提取，进行反转录。 　　临床送检样品来源长春及周边地区猪场疑似PRRS病死猪的组织病料（肺脏、脾脏、肾脏、子宫和淋巴结等），组织剪碎，在冰浴中匀浆，4 ℃静置一段时间（0.5～1.0 h），10 000 r/min 离心10 min取上清，提取RNA。取病料上清液100 μL到灭菌1.5mL离心管中，按照RNA提取试剂盒说明书提取病料RNA，进行反转录，制备cDNA，进行PCR扩增。 　　将PRRSV （CC-13株）、PCV2、CSFV、PRV病毒用合成的F/R引物进行PCR扩增。 　　用Marc-145细胞对PRRSV（CC-13株）进行病毒效价滴定，计算病毒TCID50，经测定病毒效价为105 TCID50/0.1 mL。然后依次稀释成10 000、1 000、100、10、1、0.1、0.01 TCID50，提取