叶酸维生素B12对HHcy小鼠血清TNF―αIL―6干预作用研究.docVIP

叶酸维生素B12对HHcy小鼠血清TNF―αIL―6干预作用研究 　　摘要：目的 探讨叶酸、维生素B12（VB12）对高同型半胱氨酸血症（HHcy）ApoE-/-小鼠血清TNF-α、IL-6的干预效应。方法 健康5周龄雄性纯合子ApoE-/-小鼠（SPF级近交系）36只，随机平均分为三组：模型对照组、HHcy组、干预组；另选健康5w龄雄鼠（SPF级C57BL/6J）12只作为正常对照组。喂养18w后处死，眼球取血并采用酶联免疫吸附实验（Elisa）方法测定血清Hcy及TNF-α、IL-6水平。结果 HHcy组血清同型半胱氨酸Hcy、TNF-α、IL-6水平明显高于正常对照组与模型对照组（P0.01）；干预组Hcy、TNF-α（P0.01）、IL-6（P0.05）水平与HHcy组相比均有所下降。结论 叶酸、VB12可有效降低HHcy ApoE-/-小鼠血清TNF-α、IL-6的水平，缓解HHcy引起的血管损伤。 　　关键词：叶酸；维生素B12；高同型半胱氨酸血症；TNF-α；IL-6 　　动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是血管内皮损伤后的一种缓慢而复杂的免疫炎症性增生性疾病[1]，严重危害着人类健康。研究已经证实高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia， HHcy）是AS发病的独立危险因素[2]。同型半胱氨酸（homocystein， Hcy）可通过对多种炎性因子和炎症过程的影响促进AS的发生发展[3]。炎症反应贯穿于AS起始、进展及斑块破裂血栓形成的全过程，参与炎症反应的细胞因子有TNF-α、IL-6等[4]。同属维生素B族的叶酸和维生素B12（vitamin B12， VB12），是Hcy代谢途径的重要决定因子，可以减少Hcy的生成[5]。本实验拟以ApoE-/-小鼠为实验对象，通过高蛋氨酸饮食复制ApoE-/-小鼠HHcy致AS动物模型，检测叶酸和VB12干预治疗后血清Hcy及TNF-α、IL-6的水平，探讨叶酸和VB12抗AS机制。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 健康5周龄雄鼠（SPF级C57BL/6J）12只；健康5周龄雄性纯合子ApoE-/-小鼠（SPF级近交系）36只（购自美国Jackson实验室，由北京大学实验动物中心提供）。 　　1.2实验动物分组 各组小鼠性别、年龄均相匹配，适应环境1w后，分为四组：①正常对照组（n=12）：正常小鼠饲以普通饲料配方饮食，不包含胆固醇或动物油等任何高脂成分；②模型对照组（n=12）：ApoE-/-小鼠饲以普通饲料配方饮食，不包含胆固醇或动物油等任何高脂成分；③HHcy组（n=12）：ApoE-/-小鼠饲以高蛋氨酸饮食（普通饮食中加入1.7%蛋氨酸）；④干预组（n=12）：ApoE-/-小鼠饲以干预饮食（高蛋氨酸饮食同时加0.006%叶酸和0.0004%VB12）。小鼠喂养18w后处死，进行后续试验。 　　1.3 ApoE-/-小鼠血清Hcy、TNF-α、IL-6含量检测 小鼠眼球采血后，采用ELISA法检测血清Hcy、TNF-α、IL-6水平。眼球取血，全血室温自然凝固20min，2500rpm离心20min，取上清。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本各10μL，再加样本稀释液40μL。标准品孔和样本孔中每孔加入酶标抗体100μL，37℃恒温箱温育60min，弃去液体，拍干，每孔加1mL洗涤液，静置1min，甩干，洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值，并根据标准曲线计算Hcy、TNF-α、IL-6浓度。 　　1.4 统计学方法 数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P0.05作为显著界限。 　　2结果 　　2.1各组小鼠血清Hcy水平变化 与正常对照组比较，HHcy组Hcy浓度明显升高，为正常对照组的2.29倍（P0.01），是模型对照组的1.87倍（P0.01），说明ApoE-/-小鼠HHcy模型复制成功；给予叶酸和VB12干预后，Hcy水平较HHcy组降低了27.99%，差异有显著性（P0.01），见图1。 　　2.2各组小鼠血清TNF-α、IL-6水平变化 ELISA检测结果发现，HHcy组TNF-α、IL-6水平明显高于正常对照组及模型对照组（P0.01）；给予叶酸和VB12干预后，TNF-α、IL-6水平有所降低，差异有显著性（P0.01，P0.05），见图2、图3。 　　3讨论 　　AS是心脑血管疾病的重要基础性病变，严重危害着人类的健康。有学者提出AS是具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展始终伴随炎症反应。Hcy是一种含硫氨基酸，