双特异性磷酸酶―6基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中作用.docVIP

双特异性磷酸酶―6基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中作用 　　【摘要】 目的 探讨双特异性磷酸酶-6（DUSP-6）基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR和逆转录PCR分别检测38例鼻咽癌组织和14例慢性鼻咽炎组织中双特异性磷酸酶-6基因甲基化状态及其mRNA表达情况。结果 38例鼻咽癌组织中有29例发生双特异性磷酸酶-6基因甲基化， 14例鼻咽部慢性炎症组织中无一例发生双特异性磷酸酶-6基因甲基化。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差异无统计学意义（χ2=3.217， P=0.1050.05）， 而在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中DUSP-6基因甲基化（24/26）明显高于无淋巴结转移（5/12）的鼻咽癌组织， 差异有统计学意义（χ2=13.216， P=0.0000.05）。甲基化的鼻咽癌组织中双特异性磷酸酶-6弱或无表达， 非甲基化的鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中双特异性磷酸酶-6强表达。结论 鼻咽癌中双特异性磷酸酶-6表达与其基因甲基化状态有关， 双特异性磷酸酶-6基因甲基化可能是鼻咽癌侵袭转移的重要因素。 　　【关键词】 双特异性磷酸酶-6；甲基化；鼻咽癌；转移 　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.31.020 　　DNA甲基化是基因表观遗传学的主要方式， 许多肿瘤的发生发展与基因的甲基化有关， 尤其是抑癌基因启动子区高甲基化失活在恶性肿瘤的发生中起重要作用。人类双特异性磷酸酶-6（dual-specificity phosphatase-6， DUSP-6）是双特异性磷酸酶家族成员之一， 最近发现它具有肿瘤抑制作用。本研究拟应用甲基化特异性PCR和逆转录PCR检测鼻咽癌组织中双特异性磷酸酶-6基因启动子区甲基化及其表达情况， 了解DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用机制。现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料来源 本研究中52例鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织标本来源于本院因鼻咽部新生物取活检的患者， 其中鼻咽癌组织38例， 慢性鼻咽炎组织14例。全部鼻咽癌组织经病理诊断均为未分化癌， 按照2002年国际抗癌协会TNM分期标准：Ⅰ期10 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期5例， 有淋巴结转移者26例， 无淋巴结转移者12例。所有患者在活检前均未经放疗或化疗。 　　1. 2 甲基化特异性PCR 应用DNA提取试剂盒[Tiangen Biotech （Beijing） CO.， LTD]提取上述组织的DNA， 然后用DNA修饰试剂盒（EZ DNA Methylation-Gold Kit）对上述提取的DNA进行亚硫酸氢钠处理。根据Gene Bank中DUSP-6基因序列分别设计一对甲基化和非甲基化的扩增引物， 甲基化的引物仅能对鼻咽癌或鼻咽部慢性炎症组织中DUSP-6基因甲基化的DNA扩增出相应产物， 非甲基化的引物仅能对鼻咽癌或鼻咽部慢性炎症组织中DUSP-6基因非甲基化的DNA扩增出相应产物。DUSP-6甲基化的引物序列为：5-ATATAATTTGTTTTAGTCGGTTCGT-3（正义链）， 5- 　　GATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCG-3（反义链）；DUSP-6基因非甲基化的引物为：5-AATATAATTTGTTTTAGTTGGTTTGT-3（正义链）， 5-CAATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCAC-3（反义链）。甲基化反应条件为：94℃4 min预变性， 变性94℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃30 s 35个循环， 末段延伸72℃5 min。然后将上述产物在2%琼脂糖凝胶中电泳成像分析。 　　1. 3 RT-PCR检测DUSP-6 mRNA表达 取低温保存的上述各组织约50 mg， 用TRIzol试剂提取总RNA， 然后分别用逆转录试剂盒转录成cDNA。根据GeneBank中DUSP-6基因序列设计引物， 5-GTGTCTTGGTACATTGCTTGGC-3（正义链） 和5- GTCATAGGCATCGTTCATCGAC-3 （反义链）， 作为内参照的β-actin的引物： 5-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 （正义链）和5-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3 （反义链）。反应条件为：95℃预变性 5 min ， 然后 95 ℃变性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s 35个循环， 最后末段72℃延伸5 min。反应结束后取产物5 μl用2%琼脂糖凝胶电泳并成像分析。 　　1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P0.05表示差异具有统计学意义。 　　2