名贵动物药材穿山甲DNA条形码分子鉴定研究.docVIP

名贵动物药材穿山甲DNA条形码分子鉴定研究 　　[摘要]利用COI序列作为DNA条形码对名贵珍稀动物药材穿山甲及其混伪品进行鉴定，为穿山甲药材分子鉴定提供科学依据。该实验采用试剂盒法提取穿山甲及其混伪品的基因组DNA，通过PCR扩增和双向测序，应用CodonCode Aligner软件进行校对拼接，采用MEGA 6.0软件对所有7个物种的56份样品进行序列比对，构建邻接（NJ）树。结果表明穿山甲药材COI序列扩增成功，所构建的NJ树结果显示穿山甲及其混伪品均可明显区分。因此，基于COI序列，应用DNA条形码技术可有效鉴定名贵动物药材穿山甲及其混伪品，为其市场监管提供了新的技术手段。 　　[关键词]穿山甲；DNA条形码；COI；分子鉴定 　　名贵动物药材穿山甲为鲮鲤科动物穿山甲Manis pentadactyla Linnaeus的鳞甲[1]，具有活血消?Y、通经下乳、消肿排脓、搜风通络的功效，用于经闭?L瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛等，是我国传统名贵珍稀中药材。现代药理表明，穿山甲在抗炎镇痛、活血化瘀等方面也有重要作用[2-4]。在我国，穿山甲主要分布于海南、福建、台湾、广东、广西、云南等地，被列为国家Ⅱ级保护野生动物，并被《中国濒危动物红皮书》列为易危级（vulnerable，VU），列入国际濒临绝种动植物贸易公约附录Ⅱ[5]。近年来，由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化，穿山甲数量急剧下降，资源短缺现象严重，穿山甲药材价格逐年攀升，药材市场上不断出现猪蹄甲Sus scrofa domestica、黄牛蹄甲Bos taurus、耗牛蹄甲B. grunniens、山羊蹄甲Capra hircus、绵羊蹄甲Ovis aries等混伪品，严重影响了药材质量及用药安全。目前已采用性状鉴别，显微鉴别，RFLP，Cyt b基因片段，RAPD及微卫星DNA分子标记等技术对穿山甲及其混伪品进行了鉴别[6-9]。未见基于COI序列DNA条形码分子鉴定技术对穿山甲及其混伪品鉴别的文献报道。 　　DNA条形码鉴定技术是近年来国际上生物多样性研究的热点，其核心是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定[10]。2003年，由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出将一段长度约为650 bp的COI基因序列作为动物条形码鉴定的基础片段，研究发现该序列的种间变异能较好的区分物种，随后COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因[11]。陈士林等[12]提出动物类中药材以COI为主体序列，ITS2为辅助序列鉴定中药材的方法体系。张辉等[13]选取药典中45种动物药利用COI序列进行了分子鉴定的研究。本研究利用COI序列对中药材穿山甲及其混伪品进行鉴定研究，为穿山甲药材的快速准确鉴定提供科学依据，也为临床用药安全奠定基础。 　　1 材料 　　本实验所用材料共7个物种56份样品。其中，采集到穿山甲药材样品10份，猪蹄甲4份，黄牛蹄甲4份，牦牛蹄甲1份。所有材料经长春中医药大学张辉教授鉴定，凭证样品保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料及序列的GenBank登录号分别见表1，2。 　　2 方法 　　2.1 药材DNA提取 取药材样品，无菌水浸泡后紫外线进行照射消毒30 min，然后用75%乙醇清洗表面，放置45 ℃烘箱中充分干燥，用已灭菌的手术刀，取甲片残留的腹面皮肤组织约10～25 mg，剪碎后用DNA提取研磨仪（Retsch MM400，Germany）研磨2 min（30次/s）后，使用DNeasy BloodTissue Kit提取试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）提取总DNA。 　　2.2 PCR扩增及测序 扩增引物为COI序列通用引物：正向为LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向为HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[14]。PCR反应体积为25 μL，体系内包含ddH2O 9.5 μL，2.5 μmol?L-1 引物各1.0 μL[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL（约15 ng）。PCR扩增程序为：94 ℃，1 min；94 ℃，1 min，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5个循环；94 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃，5 min。PCR扩增产物经纯化后使用ABI3730XL （Applied Biosystems Co.，USA）测序仪双向测序。 　　2.3 数据处理 测序峰图利用CodonCode Aligner V