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固定化细胞技术进行乳酸发酵生产研究 　　摘要:文章以乳酸菌为菌种,活化培养后固定于海藻酸钠、琼脂、明胶-戊二醛三种载体上,分别选取不同的接种量、胶珠直径、载体浓度、CaCl2浓度等因素设计单因素实验和正交实验,以36 h为时间范围恒温下进行发酵;通过还原糖量和酸度的测定,衡量不同条件对乳酸产量的影响,最终选出最佳发酵工艺条件。 　　关键词:乳酸发酵;固定化细胞;凝胶包埋法 　　中图分类号:TQ921 文献标识码:A 文章编号:1000-8136(2010)27-0146-02 　　 　　和游离细胞培养发酵相比,固定化细胞技术具有细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、可反复使用、能实现连续操作等优点[1],有利于提高生物反应器内微生物细胞的浓度和纯度,保持高效菌种,因此可大大提高生产能力[2]。近年来,固定化细胞技术以其低成本和可操作性强而备受瞩目,已成功地应用于生产微生物酶和其他蛋白质,此技术用于生产乳酸国内外研究尚不多见。乳酸是自然界三大有机酸之一,广泛应用于食品、医药、印染、化工和生物可降解材料等领域[3]。本实验采用凝胶包埋载体中的海藻酸钙、琼脂糖和明胶-戊二醛三种载体[4]对乳酸菌进行固定化,恒温下发酵培养,通过工艺参数的比较,找出最适合乳酸发酵的固定化细胞制作条件。 　　1材料与方法 　　1.1实验材料 　　保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌粉,由河南花花牛乳业有限公司提供;MRS液体培养基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏10,酵母浸粉5,葡萄糖20,乙酸钠2,柠檬酸氢二胺2,磷酸氢二钾2,MgSO4#8226;7H2O 0.58,MnSO4#8226;H2O 0.25,Tween 80 1 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min;其它试剂均为分析纯级。 　　1.2实验方法 　　1.2.1海藻酸钙固定化乳酸菌细胞 　　采用海藻酸钙法[5]。将菌种移入种子培养基,于37 ℃下静置培养20 h,离心洗涤菌体,接入海藻酸钠溶液中充分混匀,用注射器将此混合液滴入到CaCl2溶液中,形成的海藻酸钙凝胶珠冲洗备用。 　　1.2.2琼脂固定化乳酸菌细胞 　　将溶化的琼脂溶液与培养20 h乳酸菌发酵液混合均匀,琼脂浓度为3 %;用注射器将此混合液滴入上层是液体石蜡、下层是水的量筒中;用无菌纱布滤出颗粒,无菌水冲洗三次,备用。 　　1.2.3明胶-戊二醛固定化乳酸菌细胞 　　将明胶溶液与培养20 h乳酸菌发酵液混合均匀,明胶的最终浓度为10%左右;直接在混合液中加入戊二醛[6],搅拌均匀,倒入灭菌培养皿中凝固;将凝胶切成3×3×3 mm的小方块,用无菌水冲洗备用。 　　1.2.4DNS法测定还原糖的含量[7],酸碱滴定法测定乳酸的含量[8]。 　　2结果与分析 　　2.1固定化方法对发酵产酸耗糖的影响 　　固定化载体分别选用2%海藻酸钠、3%琼脂糖和10%明胶-戊二醛,37 ℃发酵36 h,乳酸和还原糖随时间变化的情况见图1、图2。结果表明,海藻酸钙包埋的细胞消耗还原糖的速度和产乳酸的速度高于使用琼脂和明胶-戊二醛载体,故海藻酸钙为最佳包埋载体。 　　图1固定化方法对发酵乳酸产量的影响图2固定化方法对还原糖含量的影响 　　2.2载体浓度对乳酸菌固定化效果的影响 　　选取海藻酸钠浓度分别为1%、1.5%、2%、2.5%和3%,结果见表1。可知,随着海藻酸钠浓度的增加,溶液的黏度逐渐增大,相同挤压孔径下,挤压越来越困难。当海藻酸钠浓度为1.0%时,形成的胶珠强度较弱,且易破壁,稳定性低;当海藻酸钠浓度为3.0%时,稳定性较好,但由于溶液黏度较高,固定化成球困难,且形成的固定化胶珠直径较大,硬度过强,不利于菌体生长。因此,2.0%为最佳海藻酸钠固定化细胞浓度。 　　表1海藻酸钠浓度对乳酸菌固定化效果的影响 　　海藻酸钠浓度 / % 胶珠强度 成珠难易 胶珠形状 　　1.0 较弱,易破裂 较易 偏球形 　　1.5 较弱,易破裂 易 球形 　　2.0 适中,弹性较好 适中 球形 　　2.5 适中,弹性较好 较难 球形 　　3.0 较硬,弹性较差 难 椭球形 　　图3接种量对固定化发酵乳酸的影响 　　2.3接种量对固定化发酵产酸的影响 　　在固定化细胞量5%～20%范围内,每5%为一间隔接种,比较其对产酸的影响。由图3可知,固定化细胞量为15%、20%和25%时乳酸产量较高,因此固定化细胞最适量为15%～25%。 　　2.4氯化钙浓度对固定化发酵的影响 　　海藻酸钠经发酵指标测定为最优载体,则发酵效率就要考虑CaCl2浓度的影响,在3%～7%范围内,每1%为一间隔制作不同固定化颗粒,结果表明,CaCl2浓度在3 %时,所制作的固定化细胞形状均匀,软硬适