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响应面优化诱导子促进印楝悬浮细胞培养产印楝素研究 　　摘 要 通过单因素实验法研究了水杨酸（SA）、萘乙酸（NAA）、壳聚糖（CTS）、吲哚丁酸（IBA）、茉莉酸（JA）、激动素（KT）和甲基茉莉酸（MJ） 等7种诱导剂对印楝悬浮细胞培养产印楝素的作用，筛选出SA、NAA、CTS、IBA等4种刺激效果明显的诱导剂，利用响应面法优化了该4种诱导剂的最佳组合为SA 92.00 mg/L、NAA 6.0 mg/L、CTS5 4.0 mg/L和IBA 3.0 mg/L，得到印楝素含量的实际值为8.61 mg/g，与理论预测值8.69的相对误差为0.92%。回归方程的预测值和实验值差异不显著，所得回归方程模型拟合情况良好，符合要求。 　　关键词 印楝 ；细胞悬浮培养 ；印楝素 ；响应面 　　分类号 S722.7 　　印楝（Azadirachta indica A. Juss）是一种极其安全的药用资源植物[1]，在农业、医药、环保、化妆及食品中应用广泛[2-4]。起药用效果的主要是印楝籽通过次级代谢产生的印楝素，不仅具有高效杀虫、拒食等功效，还能抑制生长发育、胃毒、呼吸和昆虫激素分泌等，并具有降低昆虫生育能力和杀灭微生物等作用[5-9]。但印楝籽1 a只产1次，数量有限，不能长久保存，且印楝籽中的印楝素含量受种源、降雨、种子形态、采样期和组培条件等因素的影响[10-11]。由于从印楝籽中提取印楝素具有局限性，因此采用悬浮细胞培养规模化开发印楝素则是行之有效的方法。梁军等[12]建立了印楝悬浮细胞培养体系，Balaji等[13]考察了生物及非生物诱导子对印楝悬浮细胞培养产印楝素的影响。考虑到诱导子之间存在协同效应，本试验研究不同诱导子如SA、NAA、CTS、IBA、JA、KT及MJ对印楝悬浮细胞培养产印楝素的影响，选择最优诱导剂，并考察它们之间相互作用的效果，以期为提高悬浮培养细胞的印楝素产量提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　印楝愈伤组织来自野生印楝籽源经固体培养基多次继代诱导培养产生的生长旺盛、色泽嫩黄、疏松易碎的组织。 　　1.2 悬浮培养系的诱导 　　将2 g愈伤组织接种到装有40 mL MS液体培养基的100 mL三角瓶中，内含不同浓度诱导子。接种后置于旋转摇床振荡培养，摇床转速为90 r/min，温度为25℃。 　　1.3 悬浮培养系的建立 　　将生长良好的细胞株培养液30 mL接种到内含蔗糖40 g/L+BA 2.0 mg/L的MS液体培养基中，500 mL的三角瓶装液量为150 mL，25 ℃培养，每天光照16 h/黑暗8 h。 　　1.4 诱导子的筛选 　　分别选用SA、NAA、CTS、IBA、JA、KT及MJ作为诱导子，其浓度如表1所示。将不同浓度的诱导子在悬浮培养诱导时加入，培养约8 d后接入已建立的悬浮培养系中，培养至第15天时收集细胞并分析印楝素的含量。用水和95%乙醇溶解的诱导子，在对照试验时分别加入同样量的水和乙醇。 　　1.5 响应面优化 　　根据单因素实验结果，分别选用SA、NAA、CTS及IBA作进一步的优化实验，实验水平如表2所示。每组实验培养至第15天时分别收集细胞并测定印楝素的含量。 　　1.6 细胞干重的测定 　　将培养好的细胞悬浮液，摇匀后取100 mL，3 000 r/min 离心20 min，沉淀用蒸馏水清洗2次，50℃烘干至恒重，称量即为细胞干质量。 　　1.7 印楝素的提取和测定 　　用甲醇萃取干细胞中的印楝素，萃取参考梁军等[12]的方法。萃取液用0.45 μm滤膜过滤，清液采用HPLC法检测样品中印楝素的含量。色谱条件为C-18柱，乙腈∶水（10∶90）为流动相，流速为0.5 mL/min，检测波长为214 nm，柱温30℃。结果以1 g干愈伤组织中印楝素的mg数表示。 　　1.8 统计分析 　　数据统计采用采用SPSS与Design Expert 8.0.6统计软件进行分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同诱导子对印楝悬浮细胞产印楝素的影响 　　2.1.1 SA对印楝悬浮细胞产印楝素的影响 　　SA对细胞干重和印楝素含量影响如表1所示。从表1可以看出，细胞干重和印楝素含量随着SA浓度的提高而提高，当SA浓度为20 mg/L时，印楝素的含量为对照的1.24倍。当SA浓度提高至80 mg/L时，印楝素含量急剧增加为对照的2.36倍。在SA所试的各种浓度之间及各浓度与对照之间，印楝素含量差异显著（P0.05），说明SA能有效诱导悬浮细胞合成印楝素。SA对印楝悬浮细胞的生长也有显著影响，SA各浓度间及各浓度与对照间差异显著（P0.05）。由此说明，SA不仅可以刺激印楝悬浮细胞的生长，而且还可以促进印楝素的生物合成。