基于UPC―QTOF―MS技术果糖诱导高尿酸血症大鼠血清脂质代谢组学研究お.docVIP

基于UPC―QTOF―MS技术果糖诱导高尿酸血症大鼠血清脂质代谢组学研究お 　　[摘要]利用脂质代谢组学技术，研究果糖诱导高尿酸血症大鼠与正常大鼠血清中脂类代谢物的变化，筛选出与高尿酸血症相关的潜在生物标记物。通过超高效合相色谱四极杆飞行时间质谱联用（UPC2Q/TOFMS）技术分析高尿酸血症大鼠（模型组）和正常大鼠（对照组）血清代谢谱图，采用多元统计分析方法比较2组的代谢谱差异，筛选出差异性代谢物。结果显示，模型组和对照组的代谢谱图存在明显差异，并筛选出11个差异代谢物，利用精确质量数结合二级质谱图初步确定了花生四烯酸、棕榈酸、油酸、亚油酸等8种潜在生物标记物。该文建立了基于UPC2Q/TOFMS技术进行果糖诱导高尿酸血症大鼠血清脂质代谢组学研究的方法，推测脂肪酸代谢异常可能与高尿酸血症的发病机制有关，为高尿酸血症的早期诊断和预防奠定科学基础。 　　[关键词]果糖；高尿酸血症；脂质代谢组学；生物标记物 　　近年来随着人们生活水平和饮食结构的改变，高尿酸血症及其相关疾病的发病率也急剧增加[1]。作为世界范围内一般人群中患病率较高的代谢性疾病，高尿酸血症在当前并未引起足够重视[2]。毒理病理学研究证实，脂代谢紊乱与代谢性疾病如糖尿病、肾病等具有相关性[34]，例如，尿酸与血脂代谢紊乱之间存在密切关系[58]。脂质代谢组学（lipidomics）作为最重要的代谢组学分支，在脂质代谢疾病的预防和诊断，脂质生物标志物、药物靶点的鉴定以及药物研发等方面都取得了重要进展[910]。 　　高尿酸血症和痛风患病率的增加与含果糖饮料的消耗增加有关[1112]。动物实验研究也表明，与其他糖类不同，高果糖饮食可引起啮齿类动物血尿酸水平快速升高[1316]，因此本实验采用文献造模方法[17]。本文应用建立的UPC2Q/TOFMS脂质代谢组学方法研究果糖诱导高尿酸血症大鼠血清代谢物的改变，确定其潜在的生物标记物，以期为高尿酸血症的早期诊断和预防提供依据。 　　1材料与方法 　　11仪器与试剂超高效合相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪（UPC2Q/TOFMS，美国Waters公司）；ACQUITY UPC2TM HSS C18 SB色谱柱（30 mm×100 mm，18 μm）；低温高速离心机（GL21M，上海卢湘仪公司）。 　　D果糖（AMRESCO）；血尿酸试剂盒（南京建成生物工程研究所，批；甲酸、醋酸铵、异丙醇（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）；氯仿、甲醇、乙腈均为分析纯；超纯水（MilliQ纯水机自制，美国Millipore公司）。 　　12动物分组与造模SD大鼠，雄性，体重（240±20） g，购自北京维通利华实验动物中心，动物合格证号SCXK（京 　　SD雄性大鼠16只，适应性喂养5 d后，按质量随机分为对照组和模型组，每组8只，喂饲普通饲料，同时对照组饮去离子水，模型组饮10%果糖水。2组动物均自由饮食、饮水，饲料和水每天更换1次，并记录饮水量。造模期间，每7 d尾静脉取血一次，连续21 d。 　　13生化学检查取静脉血1 mL，按尿酸试剂盒说明书操作。 　　14样本的预处理与UPC2Q/TOFMS分析条件静脉血3 mL，于4 ℃下4 000 r?min-1离心15 min，取上清液放入-20 ℃冰箱待用。取80 μL血清加入15 mL EP管中，加入320 μL氯仿甲醇（3∶1）涡旋2次，每次15 s，10 000 r?min-1常温离心10 min，取上清液10 μL注入液质联用仪进行分析。 　　色谱条件：ACQUITY UPC2TM HSS C18 SB色谱柱（30 mm×100 mm，18 μm）；流动相A为CO2，流动相B为02%甲酸[异丙醇甲醇（6∶1）溶液]，梯度洗脱，0～05 min，99%A，05～9 min，99%～60%A，9～10 min，60%A，10～11 min，60%～99%A，11～13 min，99%A，流速15 mL?min-1；柱温40 ℃。 　　质谱条件：采用Xevo G2S QTOFMS质谱系统，扫描范围m/z 50～1 200，离子化模式电喷雾电离（ESI），采用负离子V模式检测，毛细管电压2 500 V，离子源温度120 ℃，雾化气温度450 ℃，锥孔气流速50 L?h-1。 　　15数据处理利用Markerlynx V 41软件对原始数据进行校正和归一化处理，应用SIMCAP 1303软件（Umctrics Sweden）对样品进行分组和（正交）偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）。分析结果以二维和三维得分图和Splot图表示。以VIP1的成分作为对模型具有明显值贡献的标记物。组间比较采用t检